唐曉華，楊衛(wèi)琴，黃結貞，黃建瓊

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院檢驗科　510150;2.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院　510182)

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重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白核酸適配體的篩選及鑒定*

唐曉華1，楊衛(wèi)琴1，黃結貞1，黃建瓊2

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院檢驗科510150;2.廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院510182)

[摘要]目的篩選和鑒定重組青霉素結合蛋白2a(PBP2a)轉肽酶區(qū)蛋白的核酸適配體。方法利用指數富集的配體系統進化技術(SELEX)，以重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白為靶標，從單鏈DNA文庫中篩選能與之特異性結合的核酸適配體。篩選產物克隆測序后，對其進行結構分析和特性鑒定。結果經過11輪篩選，單鏈DNA文庫與靶標蛋白的親和力趨向穩(wěn)定，將第8、10輪篩選產物克隆測序，對獲得的40個適配體進行分析，一級結構分析顯示40個適配體并無共同的保守序列，二級結構預測分析表明，其可分為3個家族。其中13號適配體與重組PBP2a蛋白親和力最高，并能與之特異性結合。結論利用SELEX技術成功篩選出特異性結合重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白的核酸適配體，為探索耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的診療新途徑奠定基礎。

[關鍵詞]適配體；青霉素結合蛋白2a;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的耐藥機制是MecA基因編碼產生了對β-內酰胺類抗生素親合性極低的膜蛋白—青霉素結合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)所致。目前，MRSA院內外感染均嚴重，有效藥物不多，院內感染病死率極高，探索有效控制MRSA感染的新策略迫在眉睫。近年出現的核酸適配體為根本改變目前的抗菌治療窘境展示了一個全新的研究領域，課題組前期制備的重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白[1-2]為本實驗提供了一個極佳的抗菌靶點和研究優(yōu)勢。本研究以此重組蛋白為靶分子，利用指數富集的配體系統進化技術(SELEX)篩選針對MRSA PBP2a的核酸適配體，為探索MRSA感染的診療新途徑奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白為本課題組制備及保存。ssDNA文庫及引物[3]：隨機單鏈DNA文庫5′-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-45n-CTC ATG GAC GTG CTG GTG AC-3′，上游引物(P1)：5′-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3′，下游引物(P2)：5′-GTC ACC AGC ACG TCC ATG AG-3′；上游標記引物(P3) ：5′- Dig(地高辛)-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3′，下游標記引物(P4)：5′-Biotin(生物素)-GTC ACC AGC ACG TCC ATG AG-3′(上述文庫和引物皆為上海英駿公司合成)。DNA Marker購自廣州捷倍斯公司?？沟馗咝量贵w購自Jackson公司。鏈酶親和素磁珠，雙排磁力架購自Invitrogen公司。MRSA PBP2a乳膠凝集試劑盒為Biomerieux公司產品。酶標反應板購自Corning公司。硝酸纖維素膜(NC)購自BIO-RAD公司。氯金酸為Sigma公司產品。其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1PBP2a核酸適配體的篩選[3-4](1)將純化的重組PBP2a蛋白包被于96 孔板上(包被液為0.05 mol/L NaHCO3，pH9.6 的緩沖液)，4 ℃包被過夜，同時設立空白對照孔；次日洗板后，用3%牛血清清蛋白(BSA)封閉2 h。(2)隨機單鏈DNA文庫用結合緩沖液(SHCMK液：20 mmol/L Hepes pH 7.35,5 mmol/L KCl,120 mmoL/L NaCl,1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2)調至合適濃度，在95 ℃條件下變性5 min，4 ℃冷卻5 min，室溫5 min備用。(3)將ssDNA同結合緩沖液與經3%BSA封閉的空白對照孔37 ℃結合40 min，反篩去除與BSA結合的ssDNA。(4)將上清液轉移到重組PBP2a蛋白包被孔中37 ℃結合40 min；然后用洗滌緩沖液(SHCMK液+0.05%Tween 20)洗6次，洗去未結合的ssDNA；(5)再加洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，4 mol/L異硫氰酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3)于80 ℃作用10 min，洗脫下與重組PBP2a蛋白結合的ssDNA，經DNA純化試劑盒回收后，去除雜質溶解于50 μL TE緩沖液中。

1.2.2PCR條件優(yōu)化和單鏈DNA的制備以溶于TE中的ssDNA為模板，用上游引物和生物素下游引物進行PCR擴增，在第7、10、15、20、23、25個循環(huán)處分別取樣，3%瓊脂糖凝膠電泳找出最適循環(huán)數。以ssDNA為模板，用上游引物(P1)和生物素下游引物(P2)按最適合條件擴增，擴增的dsDNA產物經純化后，與鏈酶親和素磁珠結合，后用0.15 mol/L的NaOH使dsDNA變性解鏈，生物素標記的鏈與鏈酶親和素結合留在磁珠上，不帶生物素的鏈解離下來，經乙醇沉淀后，溶于TE中，測定吸光度(A)值，作為次級ssDNA文庫。重復上述步驟，經過6～11輪篩選后，測定每輪所得文庫與PBP2a的親和力，當親和力趨于飽和時，停止篩選。

1.2.3文庫與PBP2a親和力測定[3-4](1)將各輪輪篩選所得的次級ssDNA用地高辛標記的上游引物(P3)和生物素標記的下游引物(P4)進行PCR擴增，擴增出的dsDNA除非文庫鏈標記生物素以外，文庫鏈也標記上了地高辛，dsDNA經DNA純化試劑盒純化后，利用親和素磁珠級磁力架分離出地高辛標記的文庫鏈。為提高目的DNA的產量，減少非特異性條帶產生，每輪篩選后均需優(yōu)化由ssDNA擴增產生dsDNA的循環(huán)數。(2)以重組PBP2a蛋白包被96孔板上，同時設置空白對照孔包被孔，3% BSA封閉洗板后，加入地高辛標記的文庫鏈孵育洗板，再加入堿性磷酸酶標記的地高辛抗體(經滴定后的稀釋度為1∶10 000)200 μL，37 ℃孵育40 min，PBS-T洗板3次，最后1遍用ddH2O洗，二乙醇氨(DEA)緩沖液平衡5 min，棄去孔內液體排干后，加入200 μL 1 mg/mL的PNPP,30 ℃ 45 min顯色，終止反應后于酶標儀內測定A450。

1.2.4克隆與測序及適配體結構分析經8、10輪篩選得到的ssDNA，經PCR擴增成dsDNA，回收純化后連pMD19-T載體，轉化后各挑選20個克隆進行菌落PCR的鑒定，將鑒定成功的菌落送北京鼎國生物有限公司測序。根據測序結果，運用DNAMAN和mfold (http://mfold.rna.albany.edu/q=mfold/DNA-Folding-Form)，(150 mmol/L Na+,1 mmol/L Mg2+)對測序結果進行結構分析[5]。

1.2.5適配體親和力測定抽取適配體中能級較低及結構穩(wěn)定的6個含有相應適配體序列的質粒，以此為模板，按1.2.3的方法擴增及分離出地高辛標記的文庫鏈后，并測定其親和力。

1.2.6斑點膠體金滲濾法檢測適配體與PBP2a結合特異性[6-7]將親和力最高的適配體送公司合成，按文獻的方法標記于膠體金上：(1)超純水溶解氯化金使其終濃度為0.01%，加熱煮沸3 min，后每100毫升加入1 mL 1%枸櫞酸鈉溶液，迅速混勻，繼續(xù)煮沸6 min，冷卻，過濾備用；(2)取5 mL膠體金顆粒加入800 nmol適配子混勻，靜置后用2% BSA封閉多余的位點，并穩(wěn)定體系，4 ℃冰箱放置過夜。第2天取出，15 000 r/min離心1 h，吸棄上清液，以500 μL PBST重懸，4 ℃貯存至使用；(3)NC用蒸餾水浸泡20 min，室溫自然晾干。將重組PBP2a、大腸桿菌菌體蛋白提取液、MRSA菌體蛋白提取液及甲氧西林金黃色葡萄球菌(MSSA)菌體蛋白提取液(用PBP2a乳膠凝集商品試劑盒提取)及BSA分別點在NC膜上，同時設置空白對照，室溫自然晾干,用1% BSA封閉,再用PBS洗滌干燥后密閉保存于4 ℃。將制備好的抗原膜片置于濾板內，滲干液體后，每孔加入50 μL步驟(2)制備的金標適配體，再用100 μL PBST洗滌3遍，觀察有無紅色斑點出現。

2結果

2.1PCR擴增條件優(yōu)化以第1輪篩選純化的ssDNA為模板，用上游引物和生物素標記的下游引物進行PCR擴增，不同循環(huán)數下產生dsDNA電泳結果(圖1)，在PCR循環(huán)數為10時可見85 bp文庫條帶，隨著PCR循環(huán)數增加，產物量逐漸增加(泳道3、4)，但是到循環(huán)數為23時，在文庫條帶上方出現了非特異條帶(泳道5、6)，即在循環(huán)數為20(泳道4)時的PCR產物為后續(xù)實驗所用。

M:DNA Marker；1：7循環(huán)；2：10循環(huán)；3:15循環(huán)；4:20循環(huán)；5:23循環(huán)；6:25循環(huán)。

圖1ssDNA到dsDNA PCR循環(huán)數的摸索

2.2PBP2a核酸適配體的篩選及親和力測定為了獲得親和力較高的核酸適配體，在篩選過程中逐步減少BP2a蛋白量和ssDNA文庫量，并逐漸增加tRNA的濃度，整個篩選過程中ssDNA文庫及PBP2a 投入量，一共進行了11輪篩選(表1)。前8輪中，文庫的親和力隨著篩選輪數依次升高，表明文庫在慢慢富集。第9輪篩選，PBP2a的投入量減少時文庫親和力有所降低，而第10輪文庫的親和力升高但是與第8輪的差別不大，第11輪文庫的親和力又下降，表明文庫的富集已完成。選取親和力最高且相差不大的第8輪和第10輪的文庫進行了克隆和測序。各輪篩選文庫與重組PBP2a親和力，見圖2。

2.3適配體結構分析取8、10輪篩選產物進行克隆測序，并用DNAMAN軟件對測序結果進行比對分析，40個適配體序列中并無共同保守序列。用mfold分析適配體的二級結構，多為含1個或多個莖環(huán)結構，可分為3個家族，其預測的二級結構見圖3。

表1　各輪篩選的ssDNA用量及PBP2a 包被量

圖2　各輪篩選文庫與重組PBP2a親和力

A：適配體1～6；B：適配體2～13；C:適配體3～4。

圖3適配體二級結構預測圖

2.4適配體親和力測定從3個家族中選取能級較低結構較穩(wěn)定的6個適配體進行親和力測定，發(fā)現家族2中的13號適配體與PBP2a親和力最高，見圖4。

圖4　不同適配體親和力直方圖

2.5適配體特異性測定分別將BSA、MSSA菌體蛋白裂解液、重組PBP2a蛋白、MRSA菌體蛋白裂解液點在NC膜上，BSA封閉后滴加金標記的適配體，可以快速清晰地看見重組PBP2a及MRSA菌體蛋白裂解液點樣的膜上出現紅色斑點，而其MSSA菌體蛋白提取液膜上沒有紅色斑點出現，表明13號適配體不僅能特異性的與重組PBP2a相結合，還能與MRSA菌體中的天然PBP2a蛋白特異性結合，見圖5。

1：BSA；2：MSSA菌體蛋白裂解液；3：重組PBP2a蛋白；4：MRSA菌體蛋白裂解液。

圖5適配體的特異性分析

3討論

SELEX是近十幾年興起并迅速得到發(fā)展的高通量生物文庫篩選技術[8]。應用大容量的隨機寡核苷酸文庫，結合PCR體外擴增技術，以指數級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸配基，被稱為適配體[9]。適配體不僅可取代抗體用于臨床診斷和檢測，而且由于核酸適配體與蛋白特異性結合后往往能抑制蛋白的功能，可用于直接干擾疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，而且它缺乏免疫原性，體內滲透力強，因此又可作為一種很有發(fā)展前途的藥物分子用于疾病的治療。迄今篩選到的HIV、HCV、多種腫瘤及腫瘤相關因子、凝血酶、彈性蛋白酶、茶堿的適配體已在臨床檢測和治療中展示了良好的應用前景[10-12]。

MRSA的主要耐藥機制是MecA基因編碼低親和力蛋白PBP2a所致，PBP2a對β-內酰胺類抗生素親和力很低因而很少或不被該類抗生素結合，當β-內酰胺類抗生素破壞高親和力PBPs時，PBP2a的存在仍能維持細菌的生長和繁殖，表現出耐藥性。PBP2a約含有668個氨基酸，相對分子質量為78×103，由N-末端跨膜區(qū)、非青霉素結合區(qū)和轉肽酶區(qū)3個部分組成，其中轉肽酶區(qū)內含低親和力的β-內酰胺類抗生素作用位點，是PBP2a行使其主要功能即轉肽酶功能的區(qū)域[1]。

本研究以重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白為靶蛋白，篩選與之特異性結合的適配體。由于整個文庫鏈較短，只有85 bp，PCR 循環(huán)數過多很容易產生非特異性條帶，為提高篩選的有效性，本文在每一輪的篩選過程中，都對PCR循環(huán)數進行優(yōu)化，在PCR 過程中，進行一定的循環(huán)后就要取出部分PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以確定正確的PCR 循環(huán)數。

利用mfold模擬適配體的二級結構顯示，適配體的結構以莖環(huán)和口袋為主，提示二者可能是適配體與PBP2a蛋白結合的結構基礎。本研究按照其結構，將40個適配體分為3個組，每組具有共同的結構特征，它們可能與靶蛋白的不同表位相結合。對6個代表性的適配體進行親和力測試，結果顯示第2組的13號適配體與靶蛋白的親和力最高，提示大口袋小莖環(huán)結構的適配體與PPB2a蛋白的結合最緊密。

筆者采用了斑點滲濾法檢測適配體的特異性，不需特殊的儀器設備，而且操作簡便、快速。MRSA、MSSA細胞膜含有PBP1、PBP2、PBP3和PBP4，以及其他一些雜蛋白，經PBP2a乳膠凝集商品試劑盒提取液提取后點樣與NC膜上，膠體金標記的適配體能與MRSA菌體蛋白提取液發(fā)生反應而不與MSSA菌體蛋白反應，表明13號適配體不僅能特異性識別重組PBP2a蛋白，還可以識別MRSA菌體中的天然PBP2a蛋白。

綜上所述，本實驗獲得了高親和力、高特異性的重組PBP2a轉肽酶區(qū)蛋白核酸適配體，為探索MRSA感染的診療新途徑奠定基礎。

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Screening and identification of aptamers against the recombinant transpeptidase domain of PBP2a*

Tang Xiaohua1,Yang Weiqin1,Huang Jiezhen1,Huang Jianqiong2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China;2.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510182,China)

[Abstract]ObjectiveTo screen and identify the aptamers of the recombinant transpeptidase domain of PBP2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a).MethodsBy using the recombinant transpeptidase domain of PBP2a as the screening target,oligonucleotides which were capable of specifically binding to the protein were screened by a random oligonucleotide library through the stematic evolution of ligand by exponential enrichment(SELEX)technique.The ssDNA was cloned and sequenced,and the secondary structure of aptamer clones was predicted with mfold program.ResultsAfter 11 cycles of the selection,the aptamers which were capable of binding to PBP2a with high affinity have been selected.40 clones from the 8 and 10 cycles were selected randomly and sequenced.The aptamers obtained had no obvious homology according to their sequences by the sequence alignments,and the 40 aptamers were classified to three groups according to their secondary structures.The aptamer 13 was found to be specific for the target protein with the highest affinity.ConclusionAptamers for the recombinant transpeptidase domain of PBP2a with high affility and specificity were successfully screened by SELEX,which lays a foundation for exploring new ways of diagnosis and treatment of MRSA infection．

[Key words]aptamers;penicillin binding protein 2a;MRSA

doi:·技術與方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.027

*基金項目：廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20151A010102)。

作者簡介：唐曉華(1982-)，主管技師，碩士，主要從事臨床檢驗工作。

[中圖分類號]R378.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2385-04

(收稿日期：2015-12-13修回日期：2016-02-23)