姜　岑,曹春輝,李白雪,馮全生△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院　610075;2.重慶市中醫(yī)院　400011)

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艾滋病熱毒蘊(yùn)結(jié)證的miRNA差異表達(dá)研究

姜岑1,曹春輝2,李白雪1,馮全生1△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院610075;2.重慶市中醫(yī)院400011)

[摘要]目的研究艾滋病(AIDS)熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者與健康對(duì)照組間miRNA表達(dá)差異。方法運(yùn)用Agilent miRNA芯片對(duì)AIDS期熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者與健康對(duì)照組血液標(biāo)本進(jìn)行miRNA檢測(cè)，采用SAS等系統(tǒng)對(duì)組間差異miRNA進(jìn)行篩選，并對(duì)相應(yīng)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和靶基因功能顯著性分析。結(jié)果熱毒蘊(yùn)結(jié)證組與健康對(duì)照組比較，共篩選出表達(dá)有顯著性差異且倍數(shù)差異(FC)大于2的miRNA 100條，其中64條上調(diào)，36條下調(diào)。差異表達(dá)miRNAs功能涉及T細(xì)胞活化中的IL-21受體的作用、C反應(yīng)蛋白、免疫效應(yīng)的過程中的正調(diào)控等。結(jié)論AIDS熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者與健康對(duì)照組間存在差異miRNA表達(dá)，其證候生物學(xué)基礎(chǔ)可能與T細(xì)胞活化中的IL-21受體的作用等相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]獲得性免疫缺陷綜合征；熱毒蘊(yùn)結(jié)證；miRNA；靶基因

艾滋病(AIDS)是感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的致死性傳染病，目前人類還沒有完全治愈此病的方法，我國(guó)醫(yī)學(xué)在防治AIDS方面具有一定的優(yōu)勢(shì)與特色。隨著中醫(yī)藥防治AIDS臨床及科研工作的不斷深入，很多亟待解決的問題已逐漸顯現(xiàn)出來。提升中醫(yī)藥防治AIDS水平，辨證是關(guān)鍵，所以建立客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化的艾滋病中醫(yī)證候診療體系具有重要意義。miRNA是非編碼小分子RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后過程中起重要調(diào)節(jié)作用[1]。本文引入基因芯片技術(shù)研究AIDS中醫(yī)典型證候，篩選AIDS期熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者差異表達(dá)的miRNA，本文為進(jìn)一步探討AIDS中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)，為AIDS的中醫(yī)證候研究提供客觀依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料本研究的病例來自于臨床上符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的AIDS期患者，本研究納入熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者25例，健康對(duì)照受試者8例。其中，西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2011版《艾滋病診療指南》，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2004版《中醫(yī)藥治療艾滋病臨床技術(shù)方案(試行)》。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)者；(2)年齡大于18歲且小于65歲；(3)自愿參加本研究，簽署知情同意書者。符合以上所有條件者，才能納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕婦及哺乳期患者；(2)合并惡性腫瘤患者；(3)神志不清、癡呆、各種精神病患者及家屬不愿意合作者；(4)合并乙型、丙型病毒性肝炎等慢性肝病患者；(5)原發(fā)性免疫缺陷，激素化療等引起的繼發(fā)性免疫缺陷，血液病，其他原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾??；非感染HIV所患的臟器嚴(yán)重疾病;(6)研究者認(rèn)為不適合納入研究的患者,以上有一項(xiàng)是“是”者，排除觀察。

1.2方法根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)納入符合要求的病例。其中AIDS熱毒蘊(yùn)結(jié)證組25例、健康對(duì)照組8例。采集AIDS患者和健康對(duì)照組血液標(biāo)本，-80 ℃低溫保存，干冰密封保存，送往生物芯片公司，進(jìn)行Agilent基因芯片的檢測(cè)，并采用SAS差異性分析系統(tǒng)篩選差異表達(dá)miRNA的篩選，并對(duì)差異性miRNA進(jìn)行靶基因功能顯著性分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS系統(tǒng)篩選兩組間的差異表達(dá)miRNA，用Targetscan等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)，并在SAS系統(tǒng)中進(jìn)行靶基因功能顯著性分析(GO分析)。

2結(jié)果

2.1熱毒蘊(yùn)結(jié)證組與健康對(duì)照組差異miRNA熱毒蘊(yùn)結(jié)證組與健康對(duì)照組比較，共篩選出表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)且倍數(shù)差異(fold chang，F(xiàn)C)大于2的miRNA 100條，其中64條上調(diào)，36條下調(diào)，見圖1。

2.2AIDS期熱毒蘊(yùn)結(jié)證組差異miRNA分析將篩選出有顯著性差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，再用SAS系統(tǒng)對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行功能顯著性分析(GO分析)。AIDS期熱毒蘊(yùn)結(jié)證組的差異表達(dá)顯著性miRNAs靶基因預(yù)測(cè),共篩選出靶基因5 536條，其中上調(diào)miRNA共篩選出3 620條靶基因，下調(diào)miRNA共篩選出1 916條靶基因。然后將篩選出的靶基因進(jìn)行功能顯著性分析(P<0.05)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因功能主要涉及：T細(xì)胞活化IL-21受體的作用，C反應(yīng)蛋白(CRP)，免疫效應(yīng)過程中的正調(diào)控，氧化應(yīng)激，血小板，對(duì)病毒的防御反應(yīng)，干細(xì)胞分裂，分解代謝過程，水解酶活性，RNA聚合酶，補(bǔ)體激活，脂質(zhì)運(yùn)輸，信號(hào)傳導(dǎo)，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等，見圖2。

圖1　兩組差異表達(dá)的miRNA火山圖

圖2　兩組差異miRNA GO 分析(主要)

3討論

本研究選擇外周血漿中的miRNA，主要原因是miRNA和免疫系統(tǒng)關(guān)系十分密切，大量研究表明：(1)miRNA廣泛參與免疫細(xì)胞的增殖、分化、免疫應(yīng)答和免疫性疾病調(diào)控，同時(shí)與病毒感染關(guān)系密切[2-3]；(2)AIDS實(shí)質(zhì)上是免疫系統(tǒng)疾病，其感染人體及致病與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)；(3)前期研究表明，如Pegtel等[4]發(fā)現(xiàn)外周血中的miRNA可能是細(xì)胞主動(dòng)合成，而并非靶細(xì)胞凋亡后被動(dòng)釋放出來；Chen等[5]發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物外周血清、血漿中存在含量和理化性質(zhì)穩(wěn)定的miRNA，即提取外周血中的miRNA操作簡(jiǎn)便可靠。故本研究選擇外周血漿中的miRNA具有理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

熱毒蘊(yùn)結(jié)證篩選出的差異miRNA靶基因功能主要有以下方面：氧化應(yīng)激，血小板，CRP，T細(xì)胞活化IL-21受體的作用，免疫效應(yīng)的過程中的正調(diào)控，信號(hào)傳導(dǎo)、脂代謝等。

CRP是肝臟合成的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。在創(chuàng)傷、感染、炎癥反應(yīng)等情況下，血漿CRP水平迅速升高。余豐等[6]研究了CRP水平與HIV/AIDS患者抗病毒治療及預(yù)后的關(guān)系，CRP在HIV/AIDS患者中高表達(dá)，與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。在HIV/AIDS病程中，血小板減少主要與HIV對(duì)骨髓巨細(xì)胞的損害、抗血小板生成抑制、抗體形成等有關(guān)[7]，臨床上，可出現(xiàn)迫血妄行，發(fā)斑發(fā)疹，苔黃脈數(shù)等表現(xiàn)，與血小板減少癥狀相符。眾多研究證實(shí)，HIV感染者體內(nèi)處于慢性氧化應(yīng)激狀態(tài)，表現(xiàn)為HIV的復(fù)制能力增強(qiáng)，免疫細(xì)胞的增生減少，甚至喪失免疫功能。同時(shí)，HIV可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與對(duì)藥物毒性的敏感性增加[8]。韓曉群等[9]發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS患者機(jī)體氧化還原態(tài)越偏向氧化方向，標(biāo)志著AIDS患者病情的進(jìn)展。IL-21是近來發(fā)現(xiàn)的具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，研究表明[10]，HIV感染中，IL-21可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞上粒溶素和穿孔素表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的毒性和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，其可增加它們抗病毒能力，且不會(huì)引起免疫細(xì)胞的活化。

研究發(fā)現(xiàn)，在AIDS期熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者篩選出的差異miRNA中，Has-miR -126通過參與體內(nèi)脂代謝的調(diào)控，影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程[11]，其通過調(diào)控PI3K/Akt通路來調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫活性和功能[12]。Has-Let-7f能抑制記憶T細(xì)胞中IL-23的表達(dá)，但Has-Let-7f在記憶性T細(xì)胞的內(nèi)源性表達(dá)和幼稚T細(xì)胞中相比顯著偏低[13]。

綜上所述，AIDS期熱毒蘊(yùn)結(jié)證患者與健康人的體內(nèi)存在著差異表達(dá)的miRNA譜，其證候生物學(xué)基礎(chǔ)可能是與T細(xì)胞活化中的IL-21受體的作用，CRP、血小板、氧化應(yīng)激等相關(guān)。

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Research of miRNA differential expression of AIDS with the syndrome of heat-toxic accumulation

Jiang Cen1,Cao Chunhui2,Li Baixue1,Feng Quansheng1△

(1.SchoolofBasicMedicine,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;2.ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400011,China)

[Abstract]ObjectiveThe Study the difference of miRNA expression of AIDS patients with toxic heat accumulation syndrome with healthy control group.MethodsThis research used Agilent miRNA chip to test the miRNA of blood preparation,and used SAS system to screen the differences between groups,then analyzed the significance function of target gene.ResultsCompare the heat-toxic accumulation group and the healthy control group,100 cases of obvious expression difference and of which the difference was 2 times and greater were screened out (in which 64 cases showed up-regulation and 36 showed down-regulation).Differentially expressed miRNAs function involves the role of IL-21 receptor in T cell activation,C reactive protein,and the positive regulation of the immune response.ConclusionAIDS toxic heat accumulation syndrome patients and healthy control groups exist differences in miRNA expression profiles,the biological basis of syndrome maybe related to T cell activation and IL-21 receptor.

[Key words]AIDS;heat-toxic accumulation;miRNA;target gene

作者簡(jiǎn)介：姜岑(1987-),講師，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合與復(fù)方配伍研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:13688120528；E-mail:fengqs@163.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.020

[中圖分類號(hào)]R512.91

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)17-2365-02

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-11)