王　金，趙一潔，崔廣賓，尚培中△

(1.中國人民解放軍第二五一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院，石家莊 075061)

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HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌中的表達(dá)及臨床意義

王金1，趙一潔2，崔廣賓2，尚培中1△

(1.中國人民解放軍第二五一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院，石家莊 075061)

[摘要]目的探討肝細(xì)胞生長因子(HGF)與其受體(C-Met)蛋白在血清及組織中的表達(dá)及臨床意義。方法采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)42例初治膽管癌患者及20例健康對(duì)照者血清HGF及C-Met水平；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察42例膽管癌組織及正常組織HGF及C-Met的表達(dá)。結(jié)果術(shù)前1 d膽管癌患者血清中HGF蛋白與C-Met蛋白水平均高于健康對(duì)照者(1.53±0.48)ng/mLvs.(0.48±0.55)ng/mL;(16.28±5.17)ng/mLvs.(4.31±2.84)ng/mL,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第3天膽管癌患者血清中HGF蛋白與C-Met蛋白水平較術(shù)前變化不明顯，而術(shù)后第7、10天HGF蛋白與C-Met蛋白水平較術(shù)前則明顯降低。另外，HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌組織的陽性表達(dá)率分別為76.2%、81.0%，在正常組織的表達(dá)分別為15.0%、20.0%。結(jié)論HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌患者血清和組織中異常表達(dá)，可能與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]膽管腫瘤；肝細(xì)胞生長因子；C-Met蛋白；臨床病理特征

膽管癌(cholangiocarcinoma)是指起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，惡性程度高、預(yù)后差，根治性手術(shù)切除后患者的5年生存率也僅為20%～40%[1]。膽管癌細(xì)胞強(qiáng)大的局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力是膽管癌預(yù)后極差的兩大主要危險(xiǎn)因素。目前，膽管癌治療效果欠佳,預(yù)后較差,逐步提升為臨床研究重點(diǎn)之一[2]。隨著生命科學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的分子機(jī)制逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)及其受體(C-Met)蛋白在人類腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移中有重要作用，但目前對(duì)于HGF和C-Met蛋白的研究還主要集中在胃癌、肝癌、肺癌等領(lǐng)域，在膽管癌中還鮮有報(bào)道[3-4]。本研究檢測(cè)了健康者和膽管癌患者血清中HGF和C-Met蛋白的水平，并且對(duì)正常組織和膽管癌組織中HGF和C-Met蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，探討HGF和C-Met蛋白在膽管癌中的表達(dá)和臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年12月至2015年3月本院普外科收治的膽管癌患者42例(膽管癌組)，男25例，女17例，年齡36～78歲，平均(59.6±13.0)歲。全部患者均接受準(zhǔn)根治性切除手術(shù)。腫瘤大小0.4～3.8 cm。中低分化19例、高分化23例。根據(jù)2010年美國國家癌癥綜合網(wǎng)(NCAA)第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期20例。另選取同期健康對(duì)照者膽管正常組織20例(健康對(duì)照組)，術(shù)后存檔蠟塊經(jīng)EliVisionTMplus免疫組織化學(xué)染色后光鏡觀察。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑人HGF及C-Met 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購自美國Genzyme公司；兔抗人HGF和C-Met單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；EliVisionTMplus二步法試劑盒購自福州邁新生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1研究方法所有患者均于入院后術(shù)前1 d，術(shù)后第3、7、10天采集靜脈血3 mL，室溫下靜置10 min后，4 ℃下2 500 r/min離心10 min收集血清保存于-80 ℃冰箱。使用人HGF ELISA試劑盒檢測(cè)各樣本HGF水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。根據(jù)微波(microwave，MW)熱效應(yīng)原理，采用MW抗原修復(fù)EliVisionTMplus二步免疫組織化學(xué)染色方法，每例連續(xù)切片進(jìn)行HGF和C-Met標(biāo)記，每種免疫組化標(biāo)記的切片染色2張，其中1張DAB顯色后蘇木素復(fù)染用于觀察和照相，另一張不復(fù)染，用于圖像分析。每次用已知HGF和C-Met陽性標(biāo)本切片作為陽性對(duì)照。以磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液代替一抗做空白對(duì)照，以排除假陽性結(jié)果。

1.3.2結(jié)果判定HGF蛋白陽性著色主要位于腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞膜，C-Met蛋白陽性著色主要位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。結(jié)果的判定遵循雙盲法,由2名病理醫(yī)師獨(dú)立觀察。染色判定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡(×400)視野下的陽性細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)的百分率綜合判定。

2結(jié)果

2.1膽管癌術(shù)前、術(shù)后及健康對(duì)照組血清中HGF及C-Met水平比較膽管癌組患者術(shù)前1 d血清中HGF及C-Met蛋白的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第3天膽管癌組患者血清中HGF蛋白與C-Met蛋白水平較術(shù)前變化不明顯，而術(shù)后第7、10天HGF蛋白與C-Met蛋白的水平較術(shù)前則明顯降低，甚至達(dá)到正常水平。

表1　膽管癌及健康對(duì)照組術(shù)前、術(shù)后血清中

*：P<0.05：與健康對(duì)照組比較；#：P<0.05，與膽管癌組術(shù)前1 d比較。

2.2HGF及C-Met蛋白在膽管癌組織及正常膽管組織中的表達(dá)HGF及C-Met蛋白在大部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色陽性表達(dá)(圖1、2)，膽管癌組的陽性表達(dá)率明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　HGF及C-Met的在膽管癌組織及正常

A：HGF在正常膽管組織中的表達(dá)；B：HGF在膽管癌組織中的表達(dá)。

圖1HGF蛋白的表達(dá)情況(Envision，×100)

2.3HGF及C-Met蛋白在膽管癌組織表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系HGF蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤大小等其他因素?zé)o關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C-Met蛋白的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度等其他因素?zé)o關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

A：C-Met在正常膽管組織中的表達(dá)；B：C-Met在膽管癌組織中的表達(dá)。

圖2　C-Met蛋白的表達(dá)情況(Envision，×100)

3討論

膽管癌已成為臨床較為常見的惡性腫瘤，早期發(fā)病無明顯臨床癥狀，國內(nèi)流行病學(xué)資料證實(shí)膽管癌的發(fā)生率和病死率逐漸增加，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因是缺乏有效的診斷和治療手段。膽管癌并無特異性的腫瘤標(biāo)志物，僅CA19-9、CA125、癌胚抗原(CEA) 有一定價(jià)值，但是這些腫瘤標(biāo)志物沒有較高的特異度與靈敏度[5]。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的逐漸深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、HGF、IL-6等能促進(jìn)膽管細(xì)胞DNA合成[6-8]。HGF是一種多功能細(xì)胞因子,盡管其結(jié)構(gòu)、基因序列等已明確,但其在膽管癌中發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不完全清楚?；A(chǔ)研究表明，HGF具有促有絲分裂活性,可以促進(jìn)膽管癌的轉(zhuǎn)移，但臨床上關(guān)于HGF對(duì)膽管癌的影響的報(bào)道卻很少見[9]。C-Met是從NIH3T3 細(xì)胞中克隆出來的一種原癌基因，屬于酪氨酸激酶家族的成員，也是HGF惟一的受體。目前已經(jīng)證實(shí)C-Met 參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生，并且有文獻(xiàn)報(bào)道C-Met也參與膽管癌的發(fā)生過程[10-12]。因此，本研究期望通過檢測(cè)血清中HGF蛋白與C-Met蛋白的水平及在膽管癌組織中的表達(dá)，探討其具有的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清中HGF的水平較健康人明顯升高，這與國外學(xué)者Balaban等[13]的研究較為相似。據(jù)此，筆者檢測(cè)了HGF在膽管癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HGF蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM分期相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小等其他因素?zé)o關(guān)；C-Met蛋白的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關(guān)。

有研究表明，HGF/C-Met不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞間的黏附作用、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，還可以促進(jìn)腫瘤血管生成。有文獻(xiàn)表明，HGF/C-Met可能影響膽管癌的預(yù)后[14]。

為了研究HGF/C-Met與膽管癌預(yù)后的關(guān)系，筆者檢測(cè)了膽管癌患者術(shù)后第3、7、10天血清中HGF及C-Met的水平，我們發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第3天血清中HGF及C-Met的水平較術(shù)前并未明顯下降，但在第7、10天膽管癌患者血清中HGF及C-Met的水平明顯下降，甚至達(dá)到正常水平。因此，筆者認(rèn)為血清中HGF及C-Met的水平對(duì)預(yù)測(cè)膽管癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移具有一定的參考價(jià)值。

綜上所述，本研究結(jié)果表明HGF及C-Met在膽管癌患者血清和組織中呈高度活化，其活化對(duì)維持膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力起重要作用。本研究認(rèn)為深入認(rèn)識(shí) HGF及C-Met 在膽管癌進(jìn)展中的作用可以為開發(fā)膽管癌的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Expression and clinical significance of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma

Wang Jin1,Zhao Yijie2,Cui Guangbin2,Shang Peizhong1△

(1.DepartmentofGeneralSurgery,the251thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Zhangjiakou,Hebei075000,China;2.NorthernCollegeofHebei,Zhangjiakou,Hebei075061,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma.MethodsThe levels of HGF and C-Met were measured by ELISA,the expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma and health control was detected by immunohistochemistry.ResultsThe preoperative levels of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma were higher than the health control(P<0.05).Compared with the preoperative state,the levels of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma on the 3rd day after operation did not change significantly.However,the levels of HGF and C-Met on the postoperative 7th and 10th day decreased obviously.In addition,the expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma was 76.2%,81.0%,respectively,which is higher than that in normal tissue(P<0.01).ConclusionThere is an abnormal expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma,which may be related to the incidence and development of cholangiocarcinoma.

[Key words]cholangiocarcinoma;hepatocyte growth factor;C-Met;clinical and pathological features

作者簡(jiǎn)介：王金(1986-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事肝膽外科方向研究?！魍ㄓ嵶髡撸琓el:18903138087；E-mail:spz251@163.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.019

[中圖分類號(hào)]R735.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)17-2362-03

(收稿日期：2015-11-22修回日期：2016-01-10)