唐成佳,余天霧

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院肝膽外科，重慶永川 404000)

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NGAL及MMP9在原發(fā)性肝癌患者血清中表達(dá)及意義

唐成佳,余天霧△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院肝膽外科，重慶永川 404000)

[摘要]目的探討原發(fā)性肝癌(PHC)患者血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的變化及臨床意義。方法采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)47例PHC患者(PHC組)及19例健康體檢者健康血清中NGAL及MMP9水平，并分析二者與臨床病理的聯(lián)系，同時(shí)使用ROC曲線分析二者對(duì)PHC的診斷價(jià)值，Kaplan-Meier生存曲線分析不同NGAL、MMP9水平的生存差異。結(jié)果PHC組NGAL、MMP9水平明顯高于健康體檢者對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NGAL及MMP9的水平在Ⅲ～Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清 MMP9、NGAL檢測(cè)靈敏度分別為 70.2%和83.0%。二者聯(lián)合檢測(cè)可提高靈敏度至94.9%。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)血清NGAL水平高患者預(yù)后差。結(jié)論P(yáng)HC患者血清NGAL及MMP9與PHC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；聯(lián)合檢測(cè)血清水平NGAL及MMP9可明顯提高敏感度，對(duì)PHC診斷及預(yù)后指標(biāo)有一定的價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]原發(fā)性肝癌;中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白;基質(zhì)金屬蛋白酶9

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是指肝內(nèi)原發(fā)而非轉(zhuǎn)移的肝臟惡性腫瘤。PHC發(fā)生率占全部惡性腫瘤的5%,世界范圍內(nèi)每年大約100萬人受PHC的影響,其病死率與患病率幾乎相同。中國是PHC的發(fā)病率高的地區(qū)之一,達(dá)到全球的50%以上,PHC的病死率高,病死率及患病率均排在消化系惡性腫瘤的第2位,術(shù)后5年生存率平均僅為20%左右。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)是Kjeldsenl等[1]于1993年在研究人中性粒細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，屬于Lipocalin家族成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NGAL與多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在上述腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NGAL高表達(dá)且與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移或預(yù)后有關(guān)。而NGAL在肝癌中的表達(dá)情況，國內(nèi)外鮮見相關(guān)報(bào)道，本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)肝癌患者血清中NGAL及MMP9的表達(dá)情況，并分析二者與臨床病理的聯(lián)系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2009年3月至2010年3月在本院肝膽外科就診的47例PHC患者(PHC組)的血清，其中男24例，女23例，年齡40～85歲，平均年齡63.2歲,高分化17例，低分化30例，均在術(shù)前收集，所有診斷均經(jīng)病理切片證實(shí)；同時(shí)收集本院體檢科19例健康體檢人員血清作為健康對(duì)照組，所有入組人員均告知檢查目的，并簽署知情同意書。PHC的診斷符合中國抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)修訂的PHC的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)。采用一次性無菌肝素化的玻璃試管收集每位入組病例晨起空腹靜脈血 3 mL，3 000 r/min×10 min，取上清液分裝于無菌玻璃試管中置于-70 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑人 NGAL ELISA 檢測(cè)試劑盒、人MMP9 ELISA試劑盒均購于武漢博士德公司；酶標(biāo)儀購于Thermo公司。

1.3方法

1.3.1ELISA檢測(cè)PHC患者血清NGAL、MMP9表達(dá)ELISA檢測(cè)參照試劑盒說明書進(jìn)行。從-80 ℃冰箱中取出待測(cè)血清標(biāo)本，室溫下解凍，配置標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，37 ℃溫育30 min。洗滌液充分洗滌 4～6 次，加酶，37 ℃溫育 30 min，洗滌4～6 次，加入顯色劑 A 及B 液各 50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液，以空白孔調(diào)零，終止后 15 min內(nèi)， 于酶標(biāo)儀中405 nm 波長測(cè)量各孔的吸光度(OD)值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各待測(cè)孔中樣品濃度。

2結(jié)果

2.1兩組血清NGAL及MMP9水平比較PHC組NGAL、MMP9水平為(31.9±9.0)ng/mL、(336.1±85.7)ng/mL明顯高于健康對(duì)照組(18.0±8.6)ng/mL、(190.0±62.4)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2PHC患者血清NGAL及MMP9表達(dá)與臨床病理的聯(lián)系隨著PHC TNM分期的增加，NGAL及MMP9的表達(dá)率也逐漸增加，NGAL及MMP9的水平在Ⅲ～Ⅳ期為(33.6±7.8)ng/mL、(357.5±85.2)ng/mL，高于Ⅰ～Ⅱ期(27.4±8.4)ng/mL、(291.2±82.4)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NGAL及MMP9的水平與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及腫瘤大小、分化程度等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ROC曲線分析血清MMP9和NGAL的曲線下面積分別為0.890和0.864，血清MMP9對(duì)PHC診斷價(jià)值略高于NGAL。血清MMP9最佳臨界值為268.50 ng/mL，靈敏度和特異度分別為70.2%和94.7%；血清NGAL最佳臨界值為24.50 ng/mL，靈敏度和特異度分別為83.0%和78.9%。聯(lián)合檢測(cè)受試者血清MMP9和血清NGAL 中任一檢測(cè)結(jié)果為陽性即為患者。聯(lián)合檢測(cè)可提高靈敏度至94.9%，但特異度降低至74.7%。

圖1　不同血清NGAL水平的PHC患者的生存曲線

2.4生存分析對(duì)47例PHC患者進(jìn)行5年隨訪調(diào)查，以血清NGAL≥24.50 ng/mL，MMP9≥268.50 ng/mL為陽性；血清中NGAL<24.50 ng/mL，MMP9<268.50 ng/mL為陰性。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，MMP9、NGAL陽性組及陰性組患者的中位生存期分別為22.0、37.0個(gè)月。生存曲線顯示NGAL陽性表達(dá)者的生存時(shí)間明顯低于陰性表達(dá)(P<0.05)，而MMP9水平與患者生存時(shí)間無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見圖1、2。

圖2　不同血清MMP9水平的肝癌患者的生存曲線

3討論

我國是世界上的肝癌大國,肝癌患者總數(shù)占世界肝癌患者的55%[2]，其病死率達(dá)26.26/100 000。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。

腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移細(xì)胞外基質(zhì)的降解是首要條件?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分的重要蛋白水解酶， MMP9又稱明膠酶B(gelatinaso B) 作為MMPs家族中的重要一員?？膳c MMP9 形成復(fù)合物，拮抗 TIMP-1 對(duì) MMP9 的抑制作用，從而增加 MMP9 的活性，促進(jìn)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。此外，MMP9還可以促使血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)釋放，增加腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清中MMP9水平在PHC組明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與腫瘤的臨床分期密切相關(guān)，說明MMP9在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

NGAL是在研究 MMP9 時(shí)發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白，屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族[1]，其基因定位于染色體 9q34 上，全長為5 869 bp，其中包括 1 659 bp 的 5′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，178 bp 的 3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)，以及3 696 bp 的原初轉(zhuǎn)錄區(qū)[5]。NGAL 蛋白具有脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的典型β-折疊桶(β-barrel)結(jié)構(gòu)，它由連續(xù)氫鍵連接的8段反向平行的 β 折疊鏈構(gòu)成的，其封閉端的 β4～β5環(huán)上有游離的硫基(C87)，可與 MMP9 等蛋白分子形成二硫鍵，形成異源二聚體，再與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)形成 NGAL/MMP9/TIMP-1 三元復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)MMP9等分子的活性[6]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，NGAL與多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Zhang等[7]已使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了138例肝癌患者組織中NGAL及其受體的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織中NGAL及受體表達(dá)明顯高于癌旁組織，二者表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。Wang等[8]也發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NGAL表達(dá)明顯高于正常癌旁組織，其表達(dá)與腫瘤大小、Lauren′s 分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管浸潤有關(guān)。而也發(fā)現(xiàn)患者血清中NGAL表達(dá)與臨床病理分期有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清中NGAL表達(dá)比CA199和CEA更具有標(biāo)志性，與患者預(yù)后更相關(guān)。而結(jié)直腸腫瘤NGAL基因的表達(dá)是否參與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移尚不明確，Hu等[9]認(rèn)為，NGAL可通過MMP9依賴及非MMP9依賴(鐵依賴減少E-cadherin)的機(jī)制，減弱細(xì)胞間黏附，促進(jìn)腫瘤血管形成、浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，血清中NGAL水平與臨床病理分期密切相關(guān)，提示NGAL可能參與了腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，但也有人發(fā)現(xiàn)NGAL高表達(dá)于結(jié)腸癌組織中，但其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶卻未見表達(dá)，認(rèn)為NGAL在轉(zhuǎn)移過程中作用可能沒有發(fā)揮主要作用[10]， 在體外試驗(yàn)中，異常表達(dá)的NGAL可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的浸潤及肝轉(zhuǎn)移[11]，NGAL可能不能作為腺瘤癌變的標(biāo)志物[12]。

本研究提示，PHC組NGAL及MMP9水平明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅲ～Ⅳ期NGAL、MMP9水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，經(jīng)長期隨訪調(diào)查顯示，血清中NGAL陽性的肝癌患者的生存率低于NGAL陰性的PHC患者，NGAL陽性患者的中位生存期明顯低于NGAL陰性，提示血清中NGAL水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。血清MMP9水平與患者生存時(shí)間無明顯相關(guān)性，可能與樣本量偏小有關(guān)。ROC分析得出，單獨(dú)檢測(cè)血清NGAL、MMP9水平，其敏感度均較低，二者聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高其敏感度，而其特異度有所下降，可能由于血清 MMP9 和 NGAL 可在多種腫瘤中異常表達(dá)，故缺乏對(duì)于PHC特異性，但二者作為診斷及判斷PHC預(yù)后的指標(biāo)仍有一定的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]Kjeldsenl JA.Primary structure of NGAL.A novel protein associated with human neutrophil gelatinase[J].J Biol Chem,1993,268(14):10425-10432.

[2]Hepatol JG.Prevention of hepatocellular carcinoma in the Asia-Pacific region:consensus statements[J].J Gastroenterol Hepatol,2010,25(4):657-663.

[3]Nagase H,Visse R,Murphy G.Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs[J].Cardiovasc Res,2006,69(3):562-573.

[4]Flannery CR.MMPs and ADAMTSs:functional studies[J].Front Biosci,2006(11):544-569.

[5]Cowland JB,Borregaard N.Molecular characterization and pattern of tissue expression of the gene for neutrophil gelatinase-associated lipocalin from humans[J].Genomics,1997,45(1):17-23.

[6]Coles M,Diercks T,Muehlenweg B,et al.The solution structure and dynamics of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin[J].J Mol Biol,1999,289(1):139-157.

[7]Zhang Y,Fan Y,Mei Z.NGAL and NGALR overexpression in human hepatocellular carcinoma toward a molecular prognostic classification.[J].Cancer Epidemiology,2012,36(5):294-299.

[8]Wang HJ,He XJ,Ma YY,et al.Expressions of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in gastric cancer:a potential biomarker for prognosis and an ancillary diagnostic test[J].Anat Rec (Hoboken),2010,293(11):1855-1863.

[9]Hu L,Hittelman W,Lu T,et al.NGAL decreases E-cadherin-mediated cell-cell adhesion and increases cell motility and invasion through Rac1 in colon carcinoma cells[J].Lab Invest,2009,89(5):531-548.

[10]Candido S,Maestro R,Polesel J,et al.Roles of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in human cancer[J].Oncotarget,2014,5(6):1576-1594.

[11]Lee HJ,Lee EK,Lee KJ,et al.Ectopic expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin suppresses the invasion and liver metastasis of colon cancer cells[J].Int J Cancer,2006,118(10):2490-2497.

[12]Mclean MH,Thomson AJ,Murray GI,et al.Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in colorectal neoplastic progression:a marker of malignant potential?[J].Br J Cancer,2013,108(12):2537-2541.

Detection of peripheral NGAL and MMP9 levels and its clinical significance in primary hepatic carcinoma

Tang Chengjia,Yu Tianwu△

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedYongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Yongchuan,Chongqing404000,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the changes of matrix metalloproteinase 9(MMP9) and neutrophil gelatinase associated lipocalin(NGAL) in primary hepatic carcinoma and its clinical significance.MethodsEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the serum level of MMP9 and NGAL in 47 patients with primary hepatic carcinoma and 19 healthy controls.The association between serum MMP9 and NGAL levels with the clinicopathological features of hepatic carcinoma were evaluated.ROC curves were used to analyze the influence of MMP9 and NGAL on the diagnostic value.Kaplan-Meier method was used to evaluate the relationship between the expressions of NGAL and MMP9 and the prognosis of patients with HCC.ResultsSerum MMP9 and NGAL levels in hepatic carcinoma patients are significantly higher compared with normal controls(P≤0.05).The serum level of MMP9 and NGAL in primary hepatic carcinoma was positively correlated with TNM stage(P≤0.05).The sensitivity and specificity of MMP9 and NGAL for primary hepatic carcinoma were 70.2% and 83.0%.The sensitivity of the joint detection were 94.9%.Kaplan Meier survival curves showed that cumulative survival rates of patients with positive expression of NGAL were significantly lower than those of patients with negative expression.ConclusionMMP9 and NGAL might play an important role in gastric cancer generation and development.Monitoring of serum MMP9 and NGAL levels might be helpful for diagnosis and evaluation of prognosis for primary hepatic carcinoma.

[Key words]primary hepatic carcinoma;NGAL;matrix metalloproteinase 9

作者簡(jiǎn)介：唐成佳(1985-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肝臟腫瘤研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:13996104299;E-mail:ytw0000@163.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.017

[中圖分類號(hào)]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)17-2357-03

(收稿日期：2015-12-12修回日期：2016-02-02)