楊興林，梁躍東，洪章萍，熊金鳳，王云芬，黃　海

(1.貴州省貴陽市第五人民醫(yī)院檢驗科　550004；2.貴陽醫(yī)學院檢驗系,貴陽 550004)

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貴陽地區(qū)2013年手足口病非EV71、非CVA16型腸道病毒的檢測分析*

楊興林1，梁躍東1，洪章萍1，熊金鳳1，王云芬1，黃海2

(1.貴州省貴陽市第五人民醫(yī)院檢驗科550004；2.貴陽醫(yī)學院檢驗系,貴陽 550004)

[摘要]目的了解貴陽地區(qū)引起手足口病(HFMD)的非腸道病毒71型(EV71)、非柯薩奇病毒A(CVA)16型腸道病毒的病原構(gòu)成及優(yōu)勢型別，為貴陽地區(qū)HFMD防治工作提供依據(jù)。方法收集2013年4～6月檢測為非EV71、非CVA16型腸道病毒的HFMD患者肛拭子標本共107例。提取病毒核酸，用巢式RT-PCR法擴增病毒VP4區(qū)序列，對PCR陽性擴增產(chǎn)物進行測序，通過與GenBank收錄的序列BLAST比對確定病毒型別；并對優(yōu)勢型別進行序列和進化分析。結(jié)果107例標本中共有100例標本巢式RT-PCR檢測為陽性(93%)，其中100例PCR產(chǎn)物測序成功，經(jīng)BLAST比對后，100例標本病毒型別均得到確定：CVA6為46例，CVA10為30例，CVA5為10例，CVA2為6例，CVA3和CVA4各2例，CVB2和ECHO16各2例。CVA6在型別確定的非EV71、非CVA16型腸道病毒中占42.99%，為優(yōu)勢腸道病毒型別。結(jié)論貴陽地區(qū)引起HFMD的腸道病毒型別多樣，CVA6為非EV71、非CVA16型腸道病毒中的優(yōu)勢型別。

[關(guān)鍵詞]手足口病；腸道病毒；基因型

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)主要由腸道病毒(enteroviruses,EV) 引起的出疹發(fā)熱急性傳染病，引起HFMD的病毒屬于小RNA病毒科EV屬，引發(fā)HFMD 的有20多個血清型，包括柯薩奇病毒A組(CVAsckievirus A,CVA)的2、4、5、7、9、10、16 型等，B組(CVAsckievirus B,CVB)的1、2、3、4、5 型等；EV71型(human enterovirus 71,EV71)；?？刹《?echovirus,ECHO)等。其中以EV71及CVA16型較為常見。盡管非EV71型非CVA16型EV在HFMD病原譜中占一定比例，但目前對其構(gòu)成和分子流行病學特征尚不清楚。HFMD的疫情有傳播快、易于流行的特點，但仍以輕型普通病例為主，HFMD常規(guī)病原學檢測主要用實時熒光定量PCR(RT-PCR)對EV通用型、EV71型和CVA16型核酸進行檢測，對于引起HFMD的其他型別EV的病原構(gòu)成其報道較少，不同地區(qū)病原構(gòu)成其分布情況也有不同。

對2011年4～10月在貴陽市第五人民醫(yī)院住院期間臨床診斷為HFMD病例采集肛拭子標本1 379 份運用RT-PCR檢出率分別為EV通用型46.99%，EV71型5.80%，EV71 和柯薩奇病毒A16型2.18%[1]。2012年的檢測數(shù)據(jù)同樣以EV通用型，說明本地區(qū)其HFMD原主要以其他型EV為主。為進一步了解貴陽地區(qū)引起HFMD的非EV71、非CVA16型EV的病原構(gòu)成，筆者針對EV VP4區(qū)設(shè)計的一套分型引物進行RT-PCR，通過測序和序列比對分析對2013年4～6月其他型EV進行型別鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年4月1日至6月30日，在貴陽市第五人民醫(yī)院(貴陽市HFMD的定點醫(yī)院)感染科住院治療的HFMD患兒1 410例，年齡1個月至15歲，其中，男876例、女534例。診斷標準參照均符合《諸福棠實用兒科學》HFMD診斷標準及《手足口病診療指南》(2010年版)HFMD的診斷標準。

1.2方法

1.2.1標本的采集在患兒住院當天用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入病毒采樣管(北京友康基業(yè)生物科技有限公司)中，采樣管外表貼上帶有惟一識別號碼的標簽。于2 h內(nèi)送實驗室，-20 ℃低溫保存，2 d內(nèi)用RT-PCR檢測EV通用型、EV71、CVA16核酸，對EV通用型陽性、EV71核酸陰性、CVA16核酸陰性的標本-80 ℃低溫保存。

1.2.2EV核酸PCR熒光檢測采用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)的EV71、 CVA16 RT-PCR試劑和EV通用型RT-PCR試劑。EV通用型包括柯薩奇病毒A組4、5、6、7、9、10、16型，柯薩奇病毒B組2、5、13型，?？刹《竞虴V71型特異性核酸片段，EV71型只含 EV71的特異性RNA核酸片段，CVA16型只對16型特異性RNA核酸片段，采用一步法RT-PCR技術(shù)結(jié)合熒光探針技術(shù)進行檢測。病毒 RNA 的提取，采用磁珠柱提取法，按照上海之江生物科技有限公司RNA抽提試劑盒說明書操作。擴增反應(yīng)體系和條件按照說明書操作和設(shè)置，在羅氏Cobas′z 480 RT-PCR儀上進行檢測。熒光通道檢測選擇：選用FAM通道。結(jié)果判斷：按照說明書，檢測Ct≤38，檢測結(jié)果報告為陽性；檢測Ct值在38～40，重復(fù)檢測1次，如果重復(fù)檢測Ct值仍在38～40，則判為陰性。EV通用型試劑檢測為陽性而EV71和CVA16特異性試劑檢測為陰性的標本，則判為其他血清型EV陽性。對判為其他血清型腸道通用陽性的標本(非16、71型)，用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)CVA6型核酸測定檢測試劑、CVA10型核酸測定檢測試劑檢測，對其篩查陰性樣本進行如下方法測序鑒定。

1.2.3其他血清型EV檢測采用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒,按照說明書操作從140 μL肛拭子病毒保存液提取RNA,提取的RNA最終溶解在50 μL無菌無核酸酶水中備用。參考Ishiko等[2]針對EV VP4區(qū)設(shè)計的一套分型引物進行RT-PCR。以O(shè)L68-1/MD91為引物，按OneStep RT-PCR Kit(購自QIAGEN公司)說明書配制第1輪PCR體系，反應(yīng)條件如下： 50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取第1輪PCR產(chǎn)物5 μL，以O(shè)L68-1/EVP4為引物，進行第2輪PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ lrain，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。其他血清型EV檢測引物序列見表1。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1% TAE 瓊脂糖凝膠電泳。PCR陽性產(chǎn)物送北京諾賽基因公司切膠純化回收后測序。將測序結(jié)果與GenBank中的EV核苷酸序列進行BLAST比對，確定病毒型別。

表1　其他血清型EV檢測引物序列

2結(jié)果

2.1臨床EV RT-PCR檢測結(jié)果在1 410例臨床標本中，EV通用型的陽性為702例，檢出率為49.79%。其中EV71 75例，占5.32%；CVA16陽性73例，占5.18%；EV71與CVA16同時陽性2例，占0.14%，其他血清型EV552例，占39.15%，分布比例見表2，檢測EV部分標本熒光RT-PCR曲線見圖1。

表2　1 410例標本PCR熒光檢測EV結(jié)果

圖1　EV通用型RT-PCR檢測

圖2　電泳圖

EV型別陽性數(shù)(n)檢出率(%)(陽性/標本總數(shù),n/n)CVA64642.99(46/107)CVA103028.04(30/107)CVA265.61(6/107)CVA321.87(2/107)CVA421.87(2/107)CVA5109.35(10/107)CVB221.87(2/107)ECHO1621.87(2/107)無擴增76.54(7/107)總計107100.00(107/107)

2.2其他型EV的檢測結(jié)果在RT-PCR檢測EV通用型陽性，而EV71和CVA16檢測陰性的標本1 410例樣本中，抽取107例樣本，用RT-PCR法進行CVA6、CVA10檢測，對CVA6、CVA10檢測性樣本用EVVP4區(qū)設(shè)計的一套分型引物進行RT-PCR，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank EV核苷酸序列經(jīng)BLAST比對。107例標本病毒型別得到結(jié)果：CVA10型30例，CVA6型46例，CVA5型10例，CVA2型6例，CVA3型2例，CVA4型2例，CVB2型2例，ECHO16型2例，另有7份PCR產(chǎn)物沒有擴增，需進一步研究(表3)，部分條帶電泳圖，見圖2。

3討論

HFMD自1957年在新西蘭首次報道后呈世界范圍內(nèi)流行,1958 年在加拿大分離并鑒定出CVA16為本病病原，1959 年將本病命名為“手足口病”，同時發(fā)現(xiàn)早期HFMD的主要病原以CVA16為主要病原。1974年Kennett等[3]對1969～1974年美國加利福尼亞地區(qū)20例腦膜炎或腦炎的患者進行病原學檢測，首次從l例腦炎患兒(1969年)的糞便標本中分離出病毒并鑒定為EV71。1981年HFMD首次在我國上海報道，以后相繼在北京、河北、天津、福建、吉林、上東、湖北和廣東等十幾個省(市)發(fā)現(xiàn)此病。而且自2008年安徽阜陽出現(xiàn)大范圍暴發(fā)和流行以來，引起了社會的廣泛關(guān)注。2008年5月，原國家衛(wèi)生部將HFMD歸為國家法定丙類傳染病管理。

本研究運用RT-PCT對2013年貴陽地區(qū)的1 410例臨床HFMD病例進行核酸檢測，發(fā)現(xiàn)病原體主要為其他EV為主，其次為EV71和CVA16。其檢測數(shù)據(jù)與貴陽地區(qū)2010年報道數(shù)據(jù)EV通用型陽性率為 68.27%，CVA16陽性率為6.73%，EV71 陽性率為13.46%[1]。2011年報道EV通用型核酸、EV71和CVA16核酸檢出率分別為46.99%、5.80%、2.80%相比變化不大[4]。通過近年來對本地區(qū)EV病原監(jiān)測，說明本地區(qū)的HFMD病原體主要是非EV71、非CVA16型其他型EV感染，對這些未分型EV進一步分型鑒定，將有助于全面了解本地區(qū)HFMD的病原譜，同時有助于分析是否存在非EV71、非CVA16的其他優(yōu)勢病毒型別，為HFMD防控工作提供明確的病原學依據(jù)。在目前常規(guī)的病原學核酸檢測除用EV通用引物進行檢測外，只進行EV71和CVA16的分型檢測。李靜等[5]報道南京2010年EV71陽性率為44.35%，CVA16陽性率為11.29%，其他EV陽性率為3.23%，胡海贅等[6]等報道上海2009～2011年檢出EV71陽性率為31.8%，CVA16陽性率為30.5%，其他EV陽性率為10.0%。王彥霞等[7]報道河南省2008～2010年普通病例中EV71、CVA16和其他EV感染分別占51.06%、14.89%、34.05%?，F(xiàn)已明確引起HFMD的EV有多種，以EV71和CVA16最為常見，但各地報道其病原構(gòu)成也不一樣，其病原構(gòu)成具有明顯的地域性。

HFMD病毒分離培養(yǎng)是HFMD病原診斷的金標準，但因為其分離鑒定繁瑣、費力、耗時長，給快速檢測和早期診斷工作帶來困難，也無法滿足疾病流行期間同時處理大量標本的需要，近年來PCR技術(shù)已成為診斷EV感染最常用的一種方法，目前主要用于檢測EV通用、EV71和CVA16的分型。本研究通過VP4序列鑒定方法對1 410例臨床HFMD病例非EV71、非CVA16型的其他型EV隨機選出的107例進行PCR擴增及序列分析，結(jié)果為CVA6 46例、CVA10 30例、CVA5 10例、CVA2 6例，分別占其他EV的42.99%、28.04%、9.35%、5.61%；CVA3 2例、CVA4 2例、CVB2 2例、ECHO16 2例分別占其他EV的1.87%。有7例沒有擴增成功，可能是病毒含量低，或者是病毒擴增區(qū)序列變異，沒有進行設(shè)計VP1引物檢測。在已檢測的107株EV中，有46株為CVA6，有30株為CVA10，說明本地區(qū)非EV71、非CVA16型EV中的優(yōu)勢型別主要為CVA6，其次為CVA10。近年來CVA6與CVA10引起的報道較多，芬蘭2008出現(xiàn)全國范圍的HFMD大暴發(fā)，病原為CVA6和CVA10[8]，在新加坡，CVA10在HFMD病原中也占較高比例[9],2005年日本HFMD流行期間，CVA6和CVA10傳播性比EV71強，但毒力比EV71弱[10],2009年，我國山東省也發(fā)現(xiàn)了由CVA10引起的HFMD暴發(fā)[11],且近年來報道CVA6和CVA10流行的文獻陸續(xù)出現(xiàn)，提醒人們需加強對CVA6和CVA10的監(jiān)測工作。

因此，在以后的HFMD病原學監(jiān)測中應(yīng)加強對EV的分型鑒定，以全面動態(tài)地了解其病原譜及優(yōu)勢病毒型別的變化，并進一步研究其生物學特性和分子流行病學特征，為HFMD的預(yù)測、預(yù)警和防治工作提供科技支撐。

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Etiology study of hand,foot and mouth disease related non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses in Guiyang area during 2013*

Yang Xinglin1,Liang Yuedong1,Hong Zhangping1,Xiong Jinfeng1,Wang Yunfen1,Huang Hai2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFifthPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofMedicalTest,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the prevalence of non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses strains of hand,foot and mouth disease(HFMD) in Guiyang,and analyze the genetic evolution of these non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses strain,and to provide a basis for preventing and controlling (HFMD) in Guiyang.MethodsA total of 107 HFMD specimens tested positive for enteroviruses and negative for EV71 and CoxA16 were collected from April to June of 2013.The virus RNA was extracted,and the VP4 sequence was amplified by nested RT-PCR.The PCR positive products were sequenced and the enteroviruses type was identified by sequence BLAST.The sequence and phylogenetic analysis of the predominant virus type was performed.Results100 out of 107(93%)specimens were tested positive by nested RT-PCR,among which 100 PCR products were successfully sequenced.And the types of the 100 enterovirus strains were identifled by sequence BLAST：46 CoxA6,30 CoxA10,10 CoxA5,6 CoxA2,2 CoxA3 and 2 CoxA6,2 CoxB2 and 2 ECHO16.CoxA6 accounted for 42.99% in typed non-EV71,non-CoxA16 enterovimses,and was the predominant type.ConclusionHand,foot and mouth disease in Guiyang was conceded with diverse enteroviruses,and CoxA6 was the predominant type among non-EV71,non-CoxA16 enteroviruses.

[Key words]hand,foot and mouth disease;enterovirus;genotype

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.012

*基金項目：貴陽市科技局項目(筑科合[2013103]9號);貴陽市高層次創(chuàng)新型青年衛(wèi)生人才項目(筑衛(wèi)合[2013]創(chuàng)2號)。

作者簡介：楊興林(1976-)，主管檢驗技師，本科，主要從事分子生物研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:18685021938;E-mail:ldy302@163.com。

[中圖分類號]R512.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2343-03

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-26)