胡　蕾,劉　莉,張　霜,杜芳騰,張吉翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科/江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006)

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siRNA抑制HMGA1基因表達(dá)對LX-2細(xì)胞生物學(xué)功能的影響*

胡蕾,劉莉,張霜,杜芳騰△,張吉翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科/江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006)

[摘要]目的探討高遷移率蛋白A1(HMGA1)siRNA對人肝星狀細(xì)胞HMGA1、α-SMA、E-鈣黏素(E-cadherin)基因的表達(dá)調(diào)控作用及增殖活性的影響，并探討其可能的機制。方法將有效的人工合成的HMGA1 siRNA轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞LX-2(LX-2)后沉默HMGA1基因的表達(dá)。通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測LX-2細(xì)胞中HMGA1、α-SMA和E-cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)水平。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測LX-2細(xì)胞增殖水平。結(jié)果以HMGA1-siRNA序列1組沉默效果最好。TGF-β1刺激組與TGF-β1+NC-siRNA組之間細(xì)胞增殖水平、HMGA1、α-SMA、E-cadherin的基因及蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞增殖水平、HMGA1、α-SMA表達(dá)均明顯高于正常對照組(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)顯著低于正常對照組(P<0.05)；TGF-β1+HMGA1 siRNA組細(xì)胞增殖水平及HMGA1、α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)水平較另外3組均顯著下降(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。結(jié)論靶向HMGA1的siRNA能夠沉默LX-2中HMGA1的表達(dá)；抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2增殖水平，提示HMGA1參與了TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化。

[關(guān)鍵詞]高遷移率蛋白A1；RNA干擾；肝星狀細(xì)胞；肝纖維化

肝纖維化是在各種致病因素作用下肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的代償反應(yīng)，其本質(zhì)是肝臟組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)合成大于降解[1]。研究表明某些干預(yù)措施如促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解可促使肝纖維化進(jìn)程逆轉(zhuǎn)[2]。肝損傷過程中，肝星狀細(xì)胞被激活發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后能夠獲得肌成纖維細(xì)胞特性，進(jìn)而增加細(xì)胞收縮性和膠原合成，這種過程受多種細(xì)胞因子調(diào)控。Shimada等[3]用纖維化過程中的重要轉(zhuǎn)化刺激因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)24 h來激活人肝星狀細(xì)胞LX-2(hepatic stellate cell LX-2，LX-2)來構(gòu)建體外肝纖維化實驗?zāi)Ｐ?。高遷移率族蛋白A1(high mobility group AT-hook 1，HMGA1)是高遷移率族蛋白中一員，作為轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子參與真核生物的轉(zhuǎn)錄過程[4]。文獻(xiàn)報道HMGA1基因在不同胚胎起源的腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。但HMGAl在肝纖維化中的表達(dá)研究報道尚罕見。本研究旨在通過干擾人LX-2細(xì)胞中HMGA1基因的表達(dá)，研究其對LX-2生物學(xué)功能的影響，初步探討HMGA1在肝纖維化形成過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料人肝星狀細(xì)胞LX-2購自湘雅中心實驗室細(xì)胞庫。試劑：重組人TGF-β1(美國PeproTech公司)；胎牛血清(FBS,美國Hyclone公司)；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、溴化乙錠(EB，上海索來寶生物科技有限公司)；FuGENE6(美國羅氏公司)。實時熒光室量PCR(RT-PCR)所需的Trizol(美國Invitrogen公司)；Taq PCR Super Mix、DNA MarkrⅠ(北京天根生化科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermenters公司)?？偟鞍滋崛≡噭┖?北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。各目的基因引物由上海捷瑞公司合成。兔抗人HMGA1、α-SMA及E-鈣黏素(E-cadherin)單克隆抗體均購自英國Abcam公司，山羊抗鼠IgG、鼠抗人β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，上海普飛生物科技有限公司)。DEPC(Diethyl pyrocarbonate)、二甲亞砜(DMSO，美國Ameresco公司)。

1.2方法

1.2.1siRNA的設(shè)計與合成Negative siRNA control(NC-siRNA)作為陰性對照由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成，另設(shè)計與合成含3對HMGA1-siRNA序列(BC004924)的siRNA，分別是HMGA1-siRNA-1，HMGA1-siRNA-2和HMGA1-siRNA-3，見表1、2。

表1各引物序列

表2　3組特異性HMGA1 siRNA序列

1.2.2人肝星狀細(xì)胞株LX-2的培養(yǎng)及傳代用混合培養(yǎng)基DMEM[含10%胎牛血清(Hyclone )、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素]于37 ℃、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，用0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及有效HMGA1 siRNA篩查將細(xì)胞分為以下6組：空白對照組(只轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體，無特異性siRNA)、正常對照組(正常培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞)、陰性對照組(HMGA1 NC-siRNA)、HMGA1-siRNA-1組、HMGA1-siRNA-2組及HMGA1-siRNA-3組。將處于對數(shù)生長期的LX-2以2×105個/孔的密度鋪于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁達(dá)30%～50%融合率時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，換用不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基2 mL培養(yǎng)。按FuGENE6試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染后6 h，換成常規(guī)含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別提取RNA及總蛋白，采用半定量實時熒光定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測HMGA1基因和蛋白的表達(dá)，重復(fù)3次。篩選出對HMGA1干擾效果最佳的一組序列用于實驗。

1.2.4HMGA1-siRNA對經(jīng)過TGF-β1刺激后的LX-2細(xì)胞中HMGA1、α-SMA、E-cadherin表達(dá)的影響將細(xì)胞分為4組：TGF-β1刺激組(經(jīng)TGF-β1處理，未轉(zhuǎn)染)、TGF-β1+NC-siRNA組(經(jīng)TGF-β1處理，轉(zhuǎn)染加入NC siRNA)、TGF-β1+HMGA1-siRNA組(經(jīng)TGF-β1處理，轉(zhuǎn)染加入HMGA1-siRNA)、對照組(無TGF-β1刺激，未轉(zhuǎn)染)，其中培養(yǎng)液中TGF-β1終濃度為10 ng/mL。轉(zhuǎn)染步驟同前，轉(zhuǎn)染24 h后，再加入TGF-β1孵育24 h，提取各組總RNA及總蛋白，采用Western blot和半定量RT-PCR檢測HMGA1、α-SMA、E-cadherin蛋白和基因的表達(dá)。

1.2.5半定量RT-PCR檢測按Trizol試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA，取光密度(OD)260/280比值接近2.0的RNA進(jìn)行試驗。應(yīng)用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取6 μL RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴增。參照Two-Step RT-PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行RT-PCR，取2 μL cDNA，總反應(yīng)體積為25 μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴增條件，HMGA1：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。α-SMA：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。E-cadherin：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。β-actin：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含5 mg/L溴化乙錠)后，紫外燈下觀察結(jié)果。通過Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad公司)，獲得相應(yīng)組的HMGA1、α-SMA、E-cadherin mRNA的相對表達(dá)量(均以β-actin來標(biāo)化)。

1.2.6Western blot檢測按蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行Western blot檢測，提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg的蛋白調(diào)至等體積上樣，經(jīng)不同濃度(HMGA1、α-SMA、E-cadherin分別用15%、12%及6%)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，繼而把蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜用含5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉2 h，分別加封閉液稀釋的Ⅰ抗：HMGA1(1∶1 000)、α-SMA(1∶800)、E-cadherin(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)置于4 ℃孵育過夜，洗滌后加入用封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，洗滌后經(jīng)顯色、曝光、顯影、定影后拍照并觀察結(jié)果，用β-actin標(biāo)化，經(jīng)Quantity One圖像分析軟件獲得各組蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7MTT比色法檢測細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染前1 d收集對數(shù)生長期的LX-2細(xì)胞并接種于96孔板中。依1.2.3的分組及轉(zhuǎn)染方式操作。分別在每孔加入含有10%MTT溶液20 μL，常規(guī)培養(yǎng)4 h后加入DMSO。酶標(biāo)儀測定4組細(xì)胞各孔吸光度(A)值(492 nm)，計算各組均值。

2結(jié)果

2.1HMGA1基因沉默對LX-2細(xì)胞中HMGA1 mRNA、蛋白表達(dá)的影響 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后，3個干擾組的細(xì)胞內(nèi)HMGA1 mRNA表達(dá)水平均較其他對照組降低(P<0.05)。其中HMGA1-siRNA-1組干擾效果最好，mRNA表達(dá)最少(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果與半定量RT-PCR檢測一致，HMGA1的蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),見圖1、2。

2.2HMGA1-siRNA對經(jīng)過TGF-β1刺激后的LX-2細(xì)胞中HMGA1、α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)的影響半定量RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1+NC-siRNA組與TGF-β1刺激組之間E-cadherin、HMGA1、α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HMGA1、α-SMA表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)。與TGF-β1刺激組及TGF-β1+NC-siRNA組相比較，TGF-β1+HMGA1 siRNA組中HMGA1、α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果與半定量RT-PCR檢測一致，見圖3、4。

M：Marker；1：正常對照組；2：空白對照組；3：陰性對照組；4：HMGA1-siRNA-1組；5：HMGA1-siRNA-2組；6：HMGA1-siRNA-3組；*：P<0.05；**：P<0.01，與正常對照組、空白對照組、陰性對照組比較。

圖1半定量RT-PCR檢測HMGA1 siRNA轉(zhuǎn)染LX-2

細(xì)胞48 h后HMGA1的mRNA表達(dá)

1：正常對照組；2：空白對照組；3：陰性對照組；4：HMGA1-siRNA-1組；5：HMGA1-siRNA-2組；6：HMGA1-siRNA-3組；*：P<0.05；**：P<0.01，與正常對照組、空白對照組、陰性對照組比較。

圖2Western blot檢測HMGA1 siRNA轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞

48 h后HMGA1的蛋白表達(dá)情況

M：MarkerⅠ；1：對照組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1+NC-siRNA組；4：TGF-β1+HMGA1-siRNA組；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組比較。

圖3　HMGA1 siRNA對經(jīng)過TGF-β1刺激后的LX-2細(xì)胞

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NCsiRNA組比較。

2.3轉(zhuǎn)染HMGA1-siRNA后LX-2細(xì)胞增殖活力的變化TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組所測得A值與對照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TGF-β1+HMGA1-siRNA組的A值與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

1：對照組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1+NC-siRNA組；4：TGF-β1+HMGA1-siRNA組;*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組比較。

圖4HMGA1-siRNA對經(jīng)過TGF-β1刺激后的LX-2細(xì)胞

中HMGA1、α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)

3討論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是指成熟的上皮細(xì)胞經(jīng)歷了短暫結(jié)構(gòu)改變，同時細(xì)胞表型發(fā)生改變，失去部分上皮細(xì)胞用以維持細(xì)胞極性及形態(tài)，同時表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白如波形蛋白、α-SMA、成纖維細(xì)胞特異性蛋-1等，細(xì)胞遷移與侵襲能力增強，而細(xì)胞間黏附力減弱，同時可獲得抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的潛能[6-7]。EMT在促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合及器官纖維化[8-9]的過程中擔(dān)當(dāng)重要角色。上皮組織來源的腫瘤細(xì)胞可經(jīng)EMT過程實現(xiàn)其在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移行為，使細(xì)胞獲得更加適合于在細(xì)胞外環(huán)境中運動和遷移的表型。早期阻斷某些誘導(dǎo)2型EMT的配體可以逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)靜息性HSC、肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞都能經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，這表明肝實質(zhì)上皮細(xì)胞也參與了肝纖維化進(jìn)程[10-11]。因此，EMT過程在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中可能起一定作用。

資料表明，染色質(zhì)的核骨架結(jié)合序列(MARs/SARs)處，HMGA1可取代組蛋白H1，進(jìn)而活化染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[12]。HMGA1并不直接參與轉(zhuǎn)錄，而是促使其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、聚集，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始過程[13]。正常情況下，HMGA1在分化成熟的組織中幾乎不表達(dá)，而主要存在于胚胎發(fā)育期及快速增殖的細(xì)胞內(nèi)[14]。HMGA1基因生物學(xué)行為類似癌基因，位于許多腫瘤細(xì)胞染色體斷裂點簇集區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平抑制許多基因的表達(dá)。許永華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1基因和腫瘤的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著高于正常肝組織。筆者探討HMGA1通過EMT參與了肝纖維化發(fā)展。

本課題實驗結(jié)果表明，TGF-β1作用于LX-2對HMGA1基因表達(dá)有上調(diào)作用，且靶向HMGA1的siRNA能沉默LX-2細(xì)胞中HMGA1的表達(dá)，且以HMGA1-siRNA-1組的沉默效果最佳。干擾HMGA1基因可顯著抑制TGF-β1對HMGA1、α-SMA 基因和蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用；同時也可抑制TGF-β1誘導(dǎo)LX-2增殖水平的升高，減輕對E-cadherin表達(dá)的抑制作用，提示其參與了TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化。

綜上所述，HMGA1基因在以星狀細(xì)胞活化為中心的肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。本課題為HMGA1在肝纖維化中的重要作用提供了直接的理論依據(jù)。未來研究重點將轉(zhuǎn)向動物實驗，如何將其導(dǎo)入體內(nèi)并確保其有效性、安全性等諸多方面的問題有待進(jìn)一步的探索。抑制HMGA1的表達(dá)有望成為臨床防治肝纖維化的一個新靶點。

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Effects of siRNA inhibit HMGA1 gene expression on LX-2 cell biological functions*

Hu Lei,Liu Li,Zhang Shuang,Du Fangteng△,Zhang Jixiang

(DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity/KeyLaboratoryofMolecularMedicineofJiangxiProvincial,Nanchang,Jiangxi330006,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of siRNA mediated HMGA1 silence on proliferation and the gene expression of HMGA1,α-SMA and E-cadherin in activated hepatic stellate cells and its mechanisms.MethodsSynthetic HMGA1 siRNA was transfected into LX-2 cells to silence the HMGA1 gene.The expression level of HMGA1,α-SMA and E-cadherin was determined by RT-PCR and Western blot experiments.LX-2 cell proliferation was assessed by MTT assay.ResultsThe best inhibited effect was HMGA1-siRNA-1.Compared with control group,the cell proliferation and the mRNA and protein expression of HMGA1,α-SMA in TGF-β1 group and TGF-β1+NC-siRNA group were significantly increased (P<0.05),without significant differences between the two groups (P>0.05),while the expression of E-cadherin in TGF-β1 group and TGF-β1+NC-siRNA group were significantly decreased compared with control group (P<0.05).Meanwhile,the cells in TGF-β1+HMGA1 siRNA group showed significantly decreased proliferation level,down-regulated mRNA and protein expression of HMGA1,α-SMA but up-regulated expression of E-cadherin compared with TGF-β1 group and TGF-β1+NC-siRNA group(P<0.05).ConclusionHMGA1 interference could significantly down-regulate the expression of HMGA1 in LX-2 cells cultured with TGF-β1,thus inhibiting the proliferation and activation of the cells．

[Key words]high mobility group AT-hook 1;RNAi;hepatic stellate cell LX-2;liver fibrosis

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.006

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81360074)。

作者簡介：胡蕾(1987-)，碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病的研究。△通訊作者，Tel:1360708280；E-mail:jixiangz@tom.com。

[中圖分類號]R575.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2323-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-02-22)