胡大仁,程　黎,劉　燕,劉一鳴,李金政,龔建平,茍劍林△

(1.重慶三峽中心醫(yī)院肝膽外科，重慶萬(wàn)州 404000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科　400010)

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IRE1-XBP1通路調(diào)控肝巨噬細(xì)胞極性的機(jī)制研究*

胡大仁1,程黎1,劉燕1,劉一鳴2,李金政2,龔建平2,茍劍林1△

(1.重慶三峽中心醫(yī)院肝膽外科，重慶萬(wàn)州 404000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科400010)

[摘要]目的分離、培養(yǎng)LEWIS大鼠肝臟肝巨噬細(xì)胞(KCs)，觀察肌醇酶1-X盒連接蛋白1(IRE1-XBP1)通路活性改變對(duì)KCs功能的調(diào)控的作用機(jī)制。方法(1)采?、粜湍z原酶消化肝臟聯(lián)合非連續(xù)梯度離心法分離Lewis大鼠KCs；(2)鑒定后的KCs分為4組： XBP1沉默組(XBP1-shRNA組)、錯(cuò)義序列沉默對(duì)照組(Ctrl-shRNA組)；Adv-XBP1過(guò)表達(dá)組(AdV-XBP1組)、錯(cuò)義序列過(guò)表達(dá)對(duì)照組(Ctrl-AdV組)；(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組KCs中XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17轉(zhuǎn)錄水平；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)JAK1、JAK2、STAT1及STAT3的蛋白表達(dá)水平；(4)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及激光共聚焦檢測(cè)各組KCs表型的變化情況；(5)分離大鼠脾臟淋巴細(xì)胞，尼龍毛柱過(guò)濾純化T細(xì)胞，與上述各組KCs共培養(yǎng)， Brdu滲入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況；(6) Annexin V/PI法FCM觀察T淋巴細(xì)胞凋亡情況；(7)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-10水平。結(jié)果(1)RT-PCR結(jié)果顯示，XBP1-shRNA組中XBP1的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，而在Adv-XBP1組則明顯上調(diào)(P<0.05)；(2)FCM發(fā)現(xiàn)，XBP1-shRNA組中MHC-Ⅱ、CD86、CD40的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而CD204和CD206的表達(dá)則顯著高于對(duì)照組；而在Adv-XBP1組，則呈相反趨勢(shì)；(3)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)XBP1-shRNA組中JAK1、JAK2、STAT1和STAT3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平均受到抑制，而在Adv-XBP1組則上述蛋白的表達(dá)及磷酸化水平得到顯著增強(qiáng)；(4)Brdu發(fā)現(xiàn)抑制KCs 中IRE1-XBP1活性后T細(xì)胞增殖受到明顯抑制，凋亡增加，促炎細(xì)胞因子分泌減少，抗炎細(xì)胞因子分泌增加(P<0.05)，而上調(diào)KCs中IRE1-XBP1活性后T細(xì)胞增殖則明顯增強(qiáng)，凋亡明顯減少，促炎細(xì)胞因子分泌增加，抗炎細(xì)胞因子分泌減少(P<0.05)。結(jié)論KCs中IRE1-XBP1通路活性變化可以轉(zhuǎn)化KCs的極性狀態(tài)，并通過(guò)調(diào)節(jié)JAK-STAT家族成員表達(dá)，調(diào)控KCs自分泌細(xì)胞因子的組成成分；KCs中IRE1-XBP1通路活性變化可以影響共培養(yǎng)初始T淋巴細(xì)胞的增殖分化、凋亡及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。

[關(guān)鍵詞]X盒結(jié)合蛋白1;肝巨噬細(xì)胞;極性調(diào)節(jié)

目前認(rèn)為，急性排斥反應(yīng)發(fā)生的實(shí)質(zhì)是持續(xù)的炎癥反應(yīng)及炎癥因子蓄積浸潤(rùn)。而抗原遞呈細(xì)胞是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及炎癥因子趨化的核心因素[1-2]。筆者前期發(fā)現(xiàn)，作為肝血竇內(nèi)的固有巨噬細(xì)胞，也是機(jī)體最大的抗原遞呈細(xì)胞群的肝巨噬細(xì)胞(kupffer cells,KCs)，活化后具有即可促進(jìn)急性排斥反應(yīng)，也能調(diào)控下游相關(guān)耐受分子表達(dá)改變，有利于免疫抑制的雙重“性格”。但其具體機(jī)制尚不清楚。嘗試增強(qiáng)其下游耐受相關(guān)分子的表達(dá)，僅能延緩排斥反應(yīng)的發(fā)生[3-4]。其原因可能與忽略了KCs活化后M1/M2極性調(diào)節(jié)相關(guān)。

前期對(duì)肌醇酶1-X盒連接蛋白1(inositol requiring enzyme 1-X-box binding protein 1,IRE1-XBP1)通路的研究主要局限于非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)中[5]。新近文獻(xiàn)報(bào)道，IRE1-XBP1通路活性改變參與了調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分化、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)、巨噬細(xì)胞分泌性質(zhì)等諸多免疫調(diào)控環(huán)節(jié)[6-7]。而KCs作為機(jī)體最大的巨噬細(xì)胞群/APC群，IRE1-XBP1通路調(diào)控KCs的作用，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本課題組認(rèn)為,IRE1-XBP1通路可能在調(diào)控KCs功能及其自分泌細(xì)胞因子中起著關(guān)鍵作用。本研究中，筆者以大鼠肝臟KCs為靶細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染XBP1-shRNA及AdV-XBP1，觀察其功能極性的改變，以及對(duì)初始T淋巴細(xì)胞激活分化的影響，從體外實(shí)驗(yàn)的角度初步探討以KCs 中IRE1-XBP1通路為作用靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞免疫的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料健康近交系6～8周齡Lewis(Rtl1)大鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。給予標(biāo)準(zhǔn)鼠料喂養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律，正常飲水。術(shù)前8～12 h禁食。主要試劑：Ⅳ型膠原酶購(gòu)于Santa Cruz公司；小鼠抗大鼠XBP1、MCH-Ⅱ、CD86、CD204、CD206、CD163抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗大鼠JNK、JAK1、STAT3單克隆抗體購(gòu)自eBioscience公司；PrimeScriptTMRTreagent Kit試劑盒購(gòu)于Takara公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)于Sigma公司。所有操作遵守重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)指南。

1.2方法

1.2.1沉默及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建干擾質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其錯(cuò)義序列對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建交由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司代為構(gòu)建。選擇載體分別是pcDNA3.1/Hygro-IRES2-EGFP和pcDNA6.2TM-GW/EmGFP。質(zhì)粒抽取按照OMEGA質(zhì)粒抽取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最終調(diào)整質(zhì)粒濃度為500 ng/μL。參照脂質(zhì)體Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)進(jìn)行胞內(nèi)轉(zhuǎn)染操作。

1.2.2KCs分離培養(yǎng)及分組取Lewis大鼠肝組織，加入終濃度為0.1%的Ⅳ型膠原酶后劃碎并水浴，經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾后得到肝細(xì)胞懸液。經(jīng)4次離心后得到含少量紅細(xì)胞的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液。采用2 h選擇性貼壁法純化KCs。常規(guī)培養(yǎng)3 d后，取KCs種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，參照脂質(zhì)體Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染XBP1-shRNA、AdV-XBP1及其對(duì)照質(zhì)粒。分組如下：XBP1沉默組(XBP1-shRNA組，滴度為3×108TU/mL)，錯(cuò)義序列質(zhì)粒沉默對(duì)照組 (Ctrl-shRNA組，滴度為3×108TU/mL)，AdV-XBP1過(guò)表達(dá)組(AdV-XBP1組，滴度為3×108TU/mL)，錯(cuò)義序列質(zhì)粒過(guò)表達(dá)對(duì)照組(Ctrl-AdV組,滴度為3×108TU/mL)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組中XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-17 mRNA表達(dá)水平按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取KCs及肝臟總組織RNA，XBP1上游引物：5′-ATC GTC GAC CCG GGA CTA CAG GAC CAA TA-3′，下游引物：5′-GCG CAA GCT TAT GTG ATG GTC AGG GAA AGG-3′；IL-6上游引物：5′-AGA TAA CAA GAA AGA CAA AGC CAG AGT C-3′，下游引物：5′-GCA TTG GAA ATT GGG GTA GGA AG-3′；IFN-γ上游引物：5′-ATG AAC GCT ACA CAC TGC ATC-3′，下游引物：5′-TAG GCT TTC AAT GAC TGT -3′；TNF-α上游引物：5′-TCT ACT GAA CTT CGG GGT GAT CG-3′，下游引物：5′-CGT GGG CTA CAG GCT TGT A-3′；IL-17上游引物：5′-CTC AAC CGT TCC ACG TCA CCC -3′，下游引物：5′-CCA GCT TTC CCT CCG CAT-3′；利用SYBRPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒測(cè)定RNA的逆轉(zhuǎn)錄的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果采取2-△△Ct法分析表達(dá)基因的表達(dá)差異，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)各組KCs中XBP1、JAK、STAT的蛋白表達(dá)按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取KCS和移植肝臟總蛋白進(jìn)行含量測(cè)定，常規(guī)行Western blot測(cè)定，一抗?jié)舛认♂尦?∶200；二抗?jié)舛认♂尦?∶2 000顯影后BioRad系統(tǒng)捕獲圖片，Quantity One分析。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KCs表型分子表達(dá)將轉(zhuǎn)染后48 h各組KCs分為L(zhǎng)PS處理及對(duì)照兩個(gè)亞組，加入不同熒光素標(biāo)記的兔抗大鼠MHC-Ⅱ、CD206、CD204、CD40和單克隆抗體避光孵育2 h。打開(kāi)機(jī)器及氬離子光源，預(yù)熱，機(jī)器自動(dòng)初始化。用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校準(zhǔn)，熒光信號(hào)的變異系數(shù)設(shè)置小于3%。孵育相應(yīng)二抗，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)亞組取1×104個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)lowJo分析結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)及功能檢測(cè)取經(jīng)卵清蛋白(OVA)皮下免疫2次的Lewis鼠脾組織制作脾細(xì)胞懸液，經(jīng)梯度離心法獲混合淋巴細(xì)胞懸液，用尼龍毛柱(Wako)過(guò)濾純化。培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmol/L的Brdu工作液。將5×105個(gè)T細(xì)胞按5∶1比例與上述各轉(zhuǎn)染的KCs在6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行混合培養(yǎng)72 h，按照Brdu試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理，用 Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的紅光作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/核數(shù)量。將5×105個(gè)T細(xì)胞按5∶1配置與上述各組KCs在96孔板中混合培養(yǎng)72 h，每孔加入1 μg/mL OVA323-339，刺激后收集細(xì)胞液，離心后加入Annexin V-FITC及 PI，上機(jī)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm(綠光)和630 nm(紅光)，檢測(cè)凋亡。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.7ELISA檢測(cè)取各組共培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，檢測(cè)各組中IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-17的表達(dá)差異。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1各組KCs中XBP1轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的變化轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白大量表達(dá)。其轉(zhuǎn)染效率約為87%(圖1A)。RT-PCR提示：XBP1-shRNA組、Ctrl-shRNA組、AdV-XBP1組及Ctrl-AdV組中XBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.58±0.07、8.81±1.28、48.65±5.82和10.31±1.74(圖1B)。 XBP1-shRNA組中XBP1的轉(zhuǎn)錄水平較其余3組明顯受到抑制(P<0.05)，提示XBP1-shRNA質(zhì)粒有效抑制KCs中XBP1正常生理量的表達(dá)水平；而在AdV-XBP1組中，XBP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄活性較其余3組則明顯上調(diào)(P<0.05)。Western blot檢測(cè)各組KCs中XBP1蛋白表達(dá)水平，其結(jié)果顯示：XBP1-shRNA組、Ctrl-shRNA組、AdV-XBP1組及Ctrl-AdV組中XBP1的蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.14±0.04、0.49±0.01、0.84±0.02、0.53±0.07。Western blot結(jié)果(圖1C)與RT-PCR的趨勢(shì)相一致。

2.2IRE1-XBP1通路對(duì)KCs極性的影響

2.2.1IRE1-XBP1通路活性對(duì)KCs表型分子的影響MHC-Ⅱ、CD40、CD86等功能分子是決定KCs抗原呈遞細(xì)胞呈遞功能，以及活化初始T細(xì)胞功能的關(guān)鍵因子，其高表達(dá)提示KCs呈M1型極化。而CD204及CD206則是M2型KCs的表面特異性標(biāo)志物。FCM顯示：XBP1-shRNA組中MHC-Ⅱ(28.56±1.34)%、CD40(31.75±5.87)%和CD86(18.24±2.63)%較Ctrl-shRNA組MHC-Ⅱ(68.74±12.56)%、CD40(72.60±12.45)%和CD86(57.76±9.74)%明顯下調(diào)(P<0.05)。在AdV-XBP1組中，MHC-Ⅱ(89.46±21.43)%、CD40(72.60±15.74)%及CD86(86.17±24.28)%]的表達(dá)水平與Ctrl-AdV組(60.39±18.73)%、(49.24±18.45)%和(59.13±15.67)%相比則顯著增加(P<0.05)。但是CD204及CD206分子在各組中的表達(dá)水平則呈相反趨勢(shì)，CD204和CD206在XBP1-shRNA組的表達(dá)水平分別為(47.22±9.84)%和(45.67±11.37)%，較AdV-XBP1中CD204(12.54±3.41)%和CD206(12.31±3.34)%的明顯上升(P<0.05),見(jiàn)圖2A。

2.2.2IRE1-XBP1通路對(duì)KCs自分泌細(xì)胞因子的影響RT-PCR檢測(cè)上清液中促炎細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17轉(zhuǎn)錄調(diào)控變化。PCR結(jié)果(圖2B)；XBP1-shRNA組與Ctrl-shRNA組比較，IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17的mRNA表達(dá)量均受到明顯的抑制(P<0.05)；而AdV-XBP1組與Ctrl-shRNA組比較，這類(lèi)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量則明顯上調(diào)(P<0.05)。

2.3IRE-1-XBP1通路經(jīng)由JAK-STAT通路影響KCs細(xì)胞因子分泌改變結(jié)果顯示，抑制IRE1-XBP1通路的活性，JAK家族中JAK1與JAK2(圖3A)和STAT家族成員中STAT1及STAT3(圖3B)自身蛋白表達(dá)及其磷酸化水平均受到抑制(P<0.05)。而促進(jìn)IRE1-XBP1通路的表達(dá)或傳導(dǎo)，JAK家族及STAT家族上述成員的蛋白表達(dá)量及其磷酸化水平均得到顯著提升(P<0.05)。Western blot結(jié)果提示，IRE1-XBP1調(diào)控KCs自分泌細(xì)胞因子成分改變很有可能是通過(guò)JAK-STAT通路而實(shí)施的。但有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

A:轉(zhuǎn)染后48 h KCs內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)；B:RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h各組KCs中XBP1的基因轉(zhuǎn)錄水平；C:Western blot檢測(cè)KCs中XBP1蛋白的表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組KCs中XBP1轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的變化

A:各組KCs表型分子改變柱狀圖分析;B：各組KCs分泌細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。

圖2IRE1-XBP1通路對(duì)KCs極性的影響

2.4KCs中IRE1-XBP1通路活性對(duì)活化T細(xì)胞的影響

2.4.1IRE1-XBP1通路活性對(duì)活化T細(xì)胞增殖的影響B(tài)rdu摻入法檢測(cè)共培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，XBP1-shRNA組中，標(biāo)記了紅光的陽(yáng)性率為(14.69±2.31)%，較Ctrl-shRNA組的(21.32±5.41)%，T淋巴細(xì)胞分裂增殖的能力明顯受到抑制(P<0.05)。而在AdV-XBP1組中，AdV-XBP1組(40.80±7.54)%較Ctrl-AdV組(22.03±4.76)%，T淋巴細(xì)胞分裂增殖的能力得到明顯加強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖4A。

2.4.2IRE1-XBP1通路活性對(duì)活化T細(xì)胞凋亡的影響采取Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)：T淋巴細(xì)胞在XBP1-shRNA組(42.17±8.74)%凋亡明顯高于Ctrl-shRNA組(23.74±4.16)%，而在AdV-XBP1組(10.95±3.79)%凋亡明顯低于Ctrl-AdV(21.87±3.72)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4B。

A：IRE1-XBP1對(duì)JAK1和JAK2蛋白表達(dá)及磷酸化水平的調(diào)控，B：IRE1-XBP1對(duì)STAT1和STAT3蛋白表達(dá)及磷酸化水平的調(diào)控。*：P<0.05，與Ctrl-shRNA組比較;#：P<0.05，與Ctrl-AdV組比較。

圖3IRE-1-XBP1通路對(duì)JAK-STAT通路的調(diào)節(jié)

2.4.3KCs中IRE1-XBP1通路對(duì)活化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響共培養(yǎng)上清液ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17在XBP1-shRNA組中，與Ctrl-shRNA組比較，其分泌均受到不同程度的抑制；而在AdV-XBP1組，與Ctrl-AdV比較，上述4種細(xì)胞因子的分泌顯著增高(P<0.05)。但I(xiàn)L-10在XBP1-shRNA組中的水平卻明顯高于其在Ctrl-shRNA組中的表達(dá)，而AdV-XBP1組與Ctrl-AdV組比較，則IL-10分泌明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

A:各組KCs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響；B:各組KCs對(duì)T淋巴細(xì)胞凋亡的影響;*：P<0.05，與Ctrl-shRNA組比較，#：P<0.05，與Ctrl-AdV組比較。

圖4KCs中IRE1-XBP1對(duì)初始T淋巴細(xì)胞的影響

*：P<0.05,與Ctrl-shRNA組比較；#：P<0.05與Ctrl-AdV組比較。

圖5各組KCs對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子改變的影響

3討論

目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為，APCs的功能和T細(xì)胞激活分化在AcR中占據(jù)關(guān)鍵的位置，對(duì)兩者的特異性調(diào)控，可影響移植耐受或排斥免疫反應(yīng)[8]。KCs通過(guò)模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別外來(lái)抗原，再經(jīng)由TLR4等途徑，進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)生極化。M1型KCs主要由IFN-γ及LPS等因素誘導(dǎo)極化，可大量分泌促炎細(xì)胞因子、促進(jìn)Th1/Th17類(lèi)反應(yīng)，具備很強(qiáng)的抗原呈遞功能。其表面標(biāo)志物包括IL-12、MHC-Ⅱ、CD68、NOS2、IL-10等。M2型KCs與Th2型免疫反應(yīng)關(guān)系密切，極化的M2型KCs表型為IL-12、MHC-Ⅱ、IL-10、CD204、CD206、IL-1decoyR[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)抑制或上調(diào)IRE1-XBP1的活性及傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)降低KCs中IRE1-XBP1通路活性，能有效抑制經(jīng)LPS活化的KCs表面MHC-Ⅱ的表達(dá)水平，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[11]。此外，抑制這一通路的活性，也削弱共刺激分子CD40及CD68的表達(dá)。但KCs表面M2型標(biāo)志物CD204及CD206的表達(dá)水平則明顯上升，使得KCs表型改變?yōu)镸HC-Ⅱ、CD68、CD204、CD206，更符合M2型KCs的表型特征。在上調(diào)這一通路活性時(shí)，則MHC-II、CD40同CD86的表達(dá)水平得到明顯的增強(qiáng)，而CD204及CD206的表達(dá)則明顯受限。KCs表型呈MHC-Ⅱ、CD68、CD204、CD206，與M1型表型相近。此外筆者還測(cè)定了不同IRE1-XBP1活性對(duì)KCs自身分泌促炎因子的基因及蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)抑制IRE1-XBP1通路的活性， KCs自分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-17減少，而上調(diào)這一通路的活性，則明顯促進(jìn)這類(lèi)促炎因子的表達(dá)。而這一改變可能是通過(guò)對(duì)JAK1、JAK2及STAT1和STAT3的蛋白及磷酸化水平的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。但本研究未能確認(rèn)IRE1-XBP1主要調(diào)控JAK-STAT中的哪一條通路，這幾者間的關(guān)系還有待更深入的研究。以上結(jié)果證實(shí)，IRE1-XBP1的活性改變可以誘導(dǎo)KCs的極性變化。為進(jìn)一步確認(rèn)IRE1-XBP1通路誘導(dǎo)的KCs極性變化所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)改變，筆者將4組KCs分別與T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)抑制KCs中IRE1-XBP1通路，T淋巴細(xì)胞活化增殖能力被削弱，凋亡水平明顯上升，且促炎細(xì)胞因子分泌受抑制，抑炎因子分泌上調(diào)。提示KCs提呈抗原激活T細(xì)胞的能力明顯減弱，表現(xiàn)出類(lèi)似于M2型KCs的生物學(xué)效應(yīng)。而上調(diào)該通路，則表現(xiàn)出類(lèi)似于M1型KCs的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，抑制KCs中IRE1-XBP1通路的活性，可以誘導(dǎo)M1樣極化的KCs呈M2樣轉(zhuǎn)化，并表現(xiàn)出對(duì)炎癥反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控效用。為進(jìn)一步明確KCs中IRE1-XBP1通路在炎癥反應(yīng)亦或肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中的作用積累一定的理論基礎(chǔ)。

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The effect of IRE1-XBP1 pathway on regulation of polarization in activated Kupffer cells*

Hu Daren1,Cheng Li1,Liu Yan1,Liu Yiming2,Li Jinzheng2,Gong Jianping2,Gou Jianlin1△

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,ChongqingThreeGorgesCentralHospital,Wanzhou,Chongqing404000,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

[Abstract]ObjectiveTo isolate and culture rats liver KCS,and to explore the effect of IRE1-XBP1 pathway on regulation of polarization in activated Kupffer cells(KCs).Methods(1)Rat KCs were isolated by Ⅳ type collagenase digestion and gradient centrifugation methods.(2)KCs were transfected and randomly divided into four groups:XBP1-shRNA group,Ctrl-shRNA group,AdV-XBP1 group and Ctrl-AdV group.(3)The transfection level of KCs XBP1,IL-6,IFN-γ,TNF-α and IL-17 were detected by RT-PCR;the protein expression level of JAK1,JAK2,STAT1 and STAT3 were evaluated by Western blot.(4)The changes of KCs expression type in each group were detected by flow cytometry (FCM) and the laser confocal.(5)T cells derived from rat spleen cells were co-cultured within the 4 groups of KCs mentioned above;T cells proliferation was measured by Brdu labeling assay.(6)T cells apoptosis was determined by Annexin V/PI FCM analysis.(7)The density of IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17 and IL-10 in the supernatant of co culture was assessed by ELISA.Results(1)The mRNA and protein level of XBP1 were measured by RT-PCR and western blot,those in XBP1-shRNA group were significantly reduced compared with those in the other three groups,while in AdV-XBP1 groups,results demonstrated entirely the opposite tendency (P<0.05).(2)The expression of marker molecules on the surface of KCs such as MHC Ⅱ,CD86 and CD40 in XBP1-shRNA group were significantly lower (P<0.05),but CD204 and CD206 expression were much higher compared with the other three (P<0.05).However the expression tendency of these surface markers were shown the opposite results in AdV-XBP1 group (P<0.05).(3)Western blot revealed the XBP1-shRNA could statistically suppress the protein levels and phosphorylation of JAK1,JAK2,STAT1 and STAT3,which involved in the pro inflammatory cytokines regulation and KCs polarization (P<0.05).But in AdV-XBP1 group,these protein and its phosphorylation were markedly promoted (P<0.05).ELISA results collaborated with Western blot.(4)3 d after co cultured with KCs transfected with XBP1-shRNA,the levels of T lymphocyte proliferation and pro inflammatory cytokines secretion were significantly reduced,but the levels of T lymphocyte apoptosis and anti inflammatory cytokines secretion were remarkably enhanced(P<0.05).ConclusionBlockage of IRE1-XBP1 activation could alter the phenotype of active KCs to M2 like type and attenuated the capacity of antigen present of KCs,while up regulated the expression of IRE1-XBP1 pathway could change the phenotype of KCs to M1 type plus the promotion of antigen present capacity.

[Key words]X binding protein 1;Kupffer cells;polarization regulation

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.004

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200329)；重慶市衛(wèi)生局項(xiàng)目( 2013-2-168)。

作者簡(jiǎn)介：胡大仁(1978-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事肝膽胰腺疾病研究?！魍ㄓ嵶髡?Tel：13896322336;E-mail:goujianlin8899@163.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R392.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)17-2314-05

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-04)