杜尚珂，石　瑛，岳　寧，張琳琳，于海洋，賈莉婷，張　展

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科　450052)

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缺氧調(diào)控JAR細胞Stat3表達及細胞凋亡的研究*

杜尚珂，石瑛，岳寧，張琳琳，于海洋，賈莉婷，張展△

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科450052)

[摘要]目的探討缺氧對JAR細胞信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Stat3)和磷酸化Stat3(p-Stat3)蛋白表達及細胞凋亡的影響。方法在缺氧條件下培養(yǎng)JAR細胞，通過蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Stat3和p-Stat3在缺氧前后蛋白表達的差異，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平。結(jié)果缺氧培養(yǎng)JAR細胞48 h后，細胞形態(tài)發(fā)生異常改變，Stat3和p-Stat3蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡水平明顯增加(P<0.05)。結(jié)論缺氧使JAR細胞Stat3和p-Stat3蛋白表達水平降低，凋亡增加。

[關(guān)鍵詞]細胞信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3；缺氧；滋養(yǎng)細胞；凋亡

滋養(yǎng)細胞是母胎界面進行物質(zhì)交換的主要場所，早期胚胎發(fā)育及胎盤形成是在相對缺氧環(huán)境中進行[1]。自妊娠11周起，滋養(yǎng)細胞浸潤能力增加，缺氧狀態(tài)得到改善，若持續(xù)低氧會阻礙正常妊娠進行，許多妊娠期疾病與滋養(yǎng)細胞缺氧有關(guān)[2-3]，如子癇前期(preeclampsia，PE)和胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcriptions，Stats)是介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)錄因子，包括6個亞型(Stat1～Stat6)，其中Stat3研究最為廣泛。Stat3被激活時C-端的酪氨酸殘基(TryY705)和絲氨酸殘基(Ser727)位點發(fā)生磷酸化，形成磷酸化Stat3(p-Stat3)。p-Stat3調(diào)控機體細胞多項生理功能的基因轉(zhuǎn)錄，如增殖、侵襲、遷移及凋亡。在某些病理狀態(tài)下發(fā)生異常表達，如腫瘤和子癇前期。目前，尚未有研究報道缺氧能否改變滋養(yǎng)細胞Stat3的表達情況，本研究通過低氧培養(yǎng)JAR細胞，檢測缺氧后Stat3和p-Stat3在JAR細胞中的表達及細胞凋亡水平，探討滋養(yǎng)細胞缺氧與缺氧性妊娠期疾病之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料人絨毛膜癌細胞JAR細胞系(美國ATCC公司)。試劑與儀器：高糖完全培養(yǎng)基(美國Geneview公司)，二氯化鈷(CoCl2天津致遠化工)，RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(鼎國公司)，蛋白濃度測定BCA 試劑盒(康為公司)，Stat3和p-Stat3兔抗人抗體(美國CST公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組培養(yǎng)JAR細胞至對數(shù)生長期，以1×105cell/L細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板至細胞融合至80%時，更換無血清培養(yǎng)基處理細胞24 h，進行配對分組：正常組和缺氧處理組(加入CoCl2使其終濃度為300 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后進行各項檢測。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Trizol提取細胞總RNA，紫外吸收法進行RNA定量檢測，各組RNA的吸光度(A)260/280均在1.8～2.0。cDNA逆轉(zhuǎn)錄按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。每組設置3個復孔，進行RT-PCR擴增。擴增反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min進行40個擴增循環(huán)，72 ℃延伸10 min，采用2-△△CT方法計算Stat3 mRNA的相對表達量。引物由上海捷瑞生物有限公司合成，β-actin為內(nèi)參，引物序列，見表1。

表1　RT-PCR擴增的引物序列及擴增片段的大小

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測6孔板內(nèi)細胞100 μL蛋白裂解液(加入1∶100的PMSF和磷酸酶抑制劑)。BCA法測總蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，TBST清洗膜后，加Stat3和p-Stat3一抗抗體，4 ℃搖床孵育過夜。加入二抗(1∶4 000)。用ODYSSEY Clx檢測與成像系統(tǒng)進行掃描，分析條帶的灰度值。以目的蛋白條帶與內(nèi)參灰度值之比作為結(jié)果。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測消化細胞制成細胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，400目篩子過濾，凋亡檢測嚴格按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書進行操作，應用FACSCALLBUR流式細胞儀(美國BD公司)測定細胞熒光LYSISⅡ軟件分析。

2結(jié)果

2.1正常和缺氧培養(yǎng)下JAR細胞形態(tài)觀測JAR細胞缺氧培養(yǎng)48 h后，缺氧處理組細胞肉眼可見細胞凋亡增加，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞由圓形或橢圓形變成纖維樣或棘形樣細胞，細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黑色粗顆粒，見圖1。

A：正常組；B：缺氧處理組。

圖1缺氧處理JAR細胞形態(tài)圖(×100)

2.2RT-PCR檢測結(jié)果RT-PCR實驗顯示，JAR細胞經(jīng)缺氧處理缺氧處理48 h后， Stat3 mRNA的相對表達水平為1.699±0.243，與正常組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.871，P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與正常組比較。

圖2缺氧培養(yǎng)JAR細胞48 h后Stat3 mRNA的表達水平

2.3Western blot檢測結(jié)果Western blot檢測顯示，JAR細胞經(jīng)缺氧處理48 h后，與正常組比較，Stat3和p-Stat3蛋白表達均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(t=-11.260、-42.784，P<0.05)，見圖3。

A：Stat3和p-Stat3蛋白相對表達結(jié)果；B：Stat3蛋白相對表達水平；C：p-Stat3蛋白相對表達水平。*：P<0.05 ，與正常組比較。

圖3缺氧培養(yǎng)JAR細胞48 h后Stat3和p-Stat3蛋白的表達結(jié)果

2.4流式細胞術(shù)檢測結(jié)果通過流式細胞術(shù)檢測凋亡實驗結(jié)果可見，缺氧處理組的細胞凋亡率為(4.02±1.24)%，明顯高于對照組(17.83±2.04)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.692，P<0.05)，見圖4。

A：正常組；B：缺氧處理組。

圖4缺氧培養(yǎng)JAR細胞48 h后細胞凋亡水平

3討論

氧氣對滋養(yǎng)細胞增殖、分化和凋亡至關(guān)重要[4]。子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞及體外缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞細胞凋亡均增加[5]。本研究采用CoCl2化學方法建立JAR細胞缺氧模型，JAR細胞為人絨毛膜癌的轉(zhuǎn)化細胞，系滋養(yǎng)細胞來源，可提供滋養(yǎng)細胞功能方面研究；適當濃度的CoCl2能在正常氧分壓下與Fe2+競爭性結(jié)合氧分子，從而達到細胞缺氧的目的。不同細胞系[6]造成細胞缺氧環(huán)境所需CoCl2的濃度不同，當CoCl2終濃度為300 μmol/L時，JAR細胞內(nèi)HIF-1α表達水平顯著升高，細胞生長抑制顯著且無明顯細胞毒性作用。多項研究以此類細胞系作為滋養(yǎng)細胞的缺氧模型[7]。

本研究缺氧處理JAR細胞48 h后檢測Stat3的mRNA水平，以及Stat3和p-Stat3的蛋白表達水平，得出缺氧后Stat3 mRNA水平的變化與蛋白質(zhì)水平變化不一致，Stat3的mRNA水平代表其基因轉(zhuǎn)錄時狀態(tài)，但由于基因轉(zhuǎn)錄后存在更為復雜的翻譯調(diào)控作用，因此mRNA水平并不能準確代表其蛋白質(zhì)的表達水平，兩者表達之間不完全成一致性；此外，基因在不同組織、細胞和時間中所受的各種調(diào)控不同也使兩者之間不相關(guān)或負相關(guān)。缺氧環(huán)境下JAR細胞p-Stat3蛋白表達降低，且細胞發(fā)生明顯凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)惡性外周神經(jīng)鞘瘤細胞中Stat3可通過HIF-1α信號通路對細胞發(fā)揮作用[8]，在缺血大鼠的腎臟和缺氧腎癌細胞中p-Stat3可通過阻礙HIF-1α蛋白降解或增加缺氧環(huán)境中HIF-1α的合成來促進細胞內(nèi)HIF-1α水平升高，由此推測在缺氧JAR細胞中p-Stat3可能參與低氧調(diào)控的信號通路，進而參與細胞凋亡的發(fā)生。

細胞凋亡是細胞發(fā)生程序性死亡，在維持正常細胞生理功能中發(fā)揮重要作用，主要包括兩條重要通路：膜受體凋亡通路和線粒體凋亡通路。Stat3作為細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子[9]，可調(diào)控多種凋亡蛋白(p53、Bax)和抗凋亡蛋白

的基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑制細胞凋亡、促進細胞生存的作用。缺氧處理JAR細胞后，隨著p-Stat3蛋白表達降低，可使其下游抗凋亡因子表達下降，從而導致細胞凋亡增加。有研究得出重度子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞中Stat3和p-Stat3的蛋白表達水平下降[10]，滋養(yǎng)細胞凋亡增加，與本課題研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明缺氧可使p-Stat3蛋白表達降低，細胞凋亡增加。Stat3作為細胞內(nèi)參與基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，可協(xié)同其他信號通路共同發(fā)揮作用，深入探索缺氧和Stat3的相互關(guān)系可對缺氧性妊娠期疾病的病因、發(fā)病機制及預測、治療提供新思路。

參考文獻

[1]Kleppa MJ,Erlenwein SV,Darashchonak N,et al.Hypoxia and the anticoagulants dalteparin and acetylsalicylic acid affect human placental amino acid transport[J].PLoS One,2014,9(6):e99217.

[2]Zhou J,Xiao D,Hu Y,et al.Gestational hypoxia induces preeclampsia-like symptoms via heightened endothelin-1 signaling in pregnant rats[J].Hypertension,2013,62(3):599-607.

[3]Akhilesh M,Mahalingam V,Nalliah S,et al.Participation of hypoxia-inducible factor-1α in the pathogenesis of preeclampsia-related placental ischemia and its potential as a marker for preeclampsia[J].Biomarkers Genomic Med,2014,6(3):121-125.

[4]Can M,Guven B,Bektas S,et al.Oxidative stress and apoptosis in preeclampsia[J].Tissue Cell,2014,46(6):477-481.

[5]Longtine MS,Chen B,Odibo AO,et al.Villous trophoblast apoptosis is elevated and restricted to cytotrophoblasts in pregnancies complicated by preeclampsia,IUGR,or preeclampsia with IUGR[J].Placenta,2012,33(5):352-359.

[6]Hong KH,Yoo SA,Kang SS,et al.Hypoxia induces expression of connective tissue growth factor in scleroderma skin fibroblasts[J].Clin Exp Immunol,2006,146(2):362-370.

[7]夏俊霞，喬福元，吉瓊梅，等．低氧對BeWo細胞骨橋蛋白表達的影響[J]．華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2014，43(1)：48-52．

[8]Rad E,Dodd K,Thomas L,et al.STAT3 and HIF1α signaling drives oncogenic cellular phenotypes in malignant peripheral nerve sheath tumors[J].Mol Cancer Res,2015,13(7):1149-1160.

[9]Siveen KS,Sikka S,Surana R,et al.Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer:role of synthetic and natural inhibitors[J].Biochim Biophys Acta,2014,1845(2):136-154.

[10]Zhang Z,Yang X,Zhang L,et al.Decreased expression and activation of Stat3 in severe preeclampsia[J].J Mol Histol,2015,46(2):205-219.

The effects of hypoxia on the expression of Stat3 and the cell apoptosis*

Du Shangke,Shi Ying,Yue Ning,Zhang Linlin,Yu Haiyang,Jia Liting,Zhang Zhan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia on the expression of Stat3 and p-Stat3,and assessed the apoptosis ability of JAR cells in vitro.MethodsJAR cells were cultured under hypoxic conditions.Western blot were used to determine the protein expression of Stat3 and p-Stat3.Cellular apoptosis was monitored by flow cytometry analysis.ResultsAbnormal morphology changes in trophoblast cells under low oxygen conditions.After 48 h hypoxic treatment,the protein of Stat3 and p-Stat3 were significantly decreased(P<0.05);however,the level of apoptosis was significantly increased(P<0.05).ConclusionStat3 and p-Stat3 protein levels were decreased under hypoxia circumstance,while the cell apoptosis ability was increased in JAR cells.

[Key words]signal transducer and activator of transcriptions 3;hypoxia;trophoblast;apoptosis

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.003

*基金項目：河南省科技創(chuàng)新人才計劃項目(124200510005)。

作者簡介：杜尚珂(1989-)，初級檢驗技師，碩士，主要從事生殖免疫研究工作。△通訊作者,Tel:18790802060；E-mail：zhangzhanzdsfy@126.com。

[中圖分類號]R446

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2312-02

(收稿日期：2015-11-23修回日期：2016-03-09)