沈慧慧，艾力·艾山，王萬(wàn)強(qiáng)，何 薇，武耀存

(阿克蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆阿克蘇 843000)

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響應(yīng)面優(yōu)化甘草浸膏中甘草酸超聲提取工藝

沈慧慧，艾力·艾山，王萬(wàn)強(qiáng)，何 薇，武耀存

(阿克蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆阿克蘇 843000)

摘要[目的]利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取甘草浸膏中甘草酸的工藝條件。[方法]在乙醇濃度、超聲波時(shí)間及料液比等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取甘草酸的工藝條件。[結(jié)果]超聲提取甘草酸的最佳工藝條件為乙醇濃度70%、超聲波時(shí)間30 min、料液比2.8 g/L，在此條件下甘草酸含量為8.34%。[結(jié)論]建立了甘草浸膏中甘草酸超聲提取最佳工藝條件，為甘草浸膏的精深加工及進(jìn)一步研究甘草酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞響應(yīng)面分析法；甘草酸；超聲提??；甘草浸膏

甘草浸膏是由甘草加工制成的浸膏，具有和中緩急、潤(rùn)肺、解毒、調(diào)和諸藥的作用，常與化痰止咳藥配伍應(yīng)用，能減輕對(duì)咽部黏膜的刺激，并有緩解胃腸平滑肌痙攣與去氧皮質(zhì)酮樣作用，用于治療支氣管炎、咽喉炎、支氣管哮喘、慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥[1]。評(píng)價(jià)甘草浸膏質(zhì)量的重要指標(biāo)是甘草酸的含量。甘草酸及其系列產(chǎn)品，對(duì)肉瘤、乳頭瘤病毒、癌細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)艾滋病的抑制率高達(dá)90%，有較強(qiáng)的增加人體免疫功能作用，而且也是很好的食品添加劑和香料基料。

在食品工業(yè)中，常利用超聲波的空化作用來(lái)促進(jìn)物理和化學(xué)變化，提高效率，節(jié)約原料，改善產(chǎn)品質(zhì)量等[2]。目前，響應(yīng)面分析法[3-4]多用于優(yōu)選甘草切片工藝[5]，甘草酸[6-7]、甘草多糖[8-9]、光甘草定[10-11]、總黃酮[12-13]的提取工藝優(yōu)化，這些只針對(duì)甘草原料，而甘草浸膏方面的響應(yīng)面優(yōu)化尚屬空白。筆者采用新疆產(chǎn)甘草浸膏為研究對(duì)象，以甘草酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在乙醇濃度、超聲波時(shí)間、料液比等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取甘草酸的工藝條件，以期為甘草浸膏的精深加工及進(jìn)一步研究甘草酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑甘草浸膏(新疆某甘草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司)；甘草酸銨對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110731-200614)。乙腈為進(jìn)口迪馬色譜純，無(wú)水乙醇、磷酸均為分析純，水為超純水(美國(guó)Millipore公司ELIX3 QA10超純水儀處理)。

1.2儀器與設(shè)備安捷倫RRLC 1200高效液相色譜儀(美國(guó)生產(chǎn))，Elmasonic P 300H 超聲波清洗儀(德國(guó)生產(chǎn))。

1.3甘草酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法測(cè)定甘草酸含量。色譜條件：色譜柱為ODS-3(4.6 mm ×250.0 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸溶液；甘草酸檢測(cè)波長(zhǎng)為 237 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[14]。1.4單因素試驗(yàn)影響甘草酸含量的主要因素有乙醇濃度、超聲波時(shí)間、料液比。乙醇濃度采用40%、50%、60%、70%、80% 5個(gè)水平；超聲波時(shí)間采用0、10、20、30、40、50 min 6個(gè)水平；料液比采用1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L 5個(gè)水平，分別考察它們對(duì)甘草酸提取效果的影響。

1.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取合適范圍的因素參數(shù)，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，得到超聲波提取甘草酸的最佳工藝參數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，用70%乙醇制成1 mL含甘草酸銨0.2 mg(折合甘草酸為0.195 9 mg)的對(duì)照品溶液。用甘草酸銨對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，回歸方程：y=6.101 9x+4.092 9，R2=0.999 7，甘草酸銨對(duì)照品在10～160 ug/mL線性關(guān)系良好。

圖1　甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of ammonium glycyrrhetate

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1乙醇濃度對(duì)甘草浸膏中甘草酸含量的影響。固定超聲波時(shí)間為30 min，料液比為2.0 g/L，研究不同乙醇濃度對(duì)甘草酸含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度在40%～70%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，甘草酸含量呈上升趨勢(shì)，在乙醇濃度為70%時(shí)甘草酸含量達(dá)到最大，再升高乙醇濃度，甘草酸含量開始下降。可能是由于40%～70%的乙醇溶液對(duì)植物細(xì)胞組織的穿透性較強(qiáng)，對(duì)甘草酸的溶解性較好，而多糖、蛋白質(zhì)等在醇溶液中易產(chǎn)生沉淀，提取液的雜質(zhì)較少，因此，甘草酸提取效率較高。

圖2　乙醇濃度對(duì)甘草浸膏中甘草酸含量的影響Fig.2　Effects of ethanol concentration on the content of glycyrrhizic acid from licorice extract

2.2.2超聲波時(shí)間對(duì)甘草浸膏中甘草酸含量的影響。固定乙醇濃度為70%，料液比為2.0 g/L，研究不同超聲波時(shí)間對(duì)甘草酸含量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，起始階段，隨著超聲波時(shí)間的增加，甘草酸含量迅速上升，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，甘草酸含量最高；當(dāng)超聲時(shí)間為30～40 min時(shí)，甘草酸含量下降，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，甘草酸含量變化不明顯。甘草酸含量在起始階段迅速上升的主要原因可能是超聲波的空化作用產(chǎn)生極大的壓力，造成細(xì)胞壁的破裂，并在瞬間完成，同時(shí)產(chǎn)生的振動(dòng)作用強(qiáng)化了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)展和溶解，加速了樣品中組分的溶出，提取效率較高[15]。當(dāng)超聲波時(shí)間達(dá)30 min時(shí)，這種空化效應(yīng)造成的細(xì)胞破壁基本完成，甘草酸含量不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，因此，當(dāng)超聲波超過(guò)一定時(shí)間后甘草酸提取效率不再明顯上升。

2.2.3料液比對(duì)甘草浸膏中甘草酸含量的影響。固定乙醇濃度為70%，超聲波時(shí)間為30 min，研究不同料液比對(duì)甘草酸含量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，甘草酸含量隨料液比的增加而逐漸增加，這是因?yàn)榱弦罕鹊脑龃髸?huì)提高傳質(zhì)推動(dòng)力，故甘草酸含量增加。但當(dāng)料液比超過(guò)3.0 g/L時(shí)，甘草酸含量反而有所下降，這可能是由于料液比過(guò)大使甘草浸膏中的有機(jī)雜質(zhì)提取增多，不利于甘草酸的溶出。

圖3　超聲波時(shí)間對(duì)甘草浸膏中甘草酸含量的影響Fig.3　Effects of ultrasonic time on the content of glycyrrhizic acid from licorice extract

圖4　料液比對(duì)甘草浸膏中甘草酸含量的影響Fig.4　Effects of solid-liquid ratio on the content of glycyrrhizic acid from licorice extract

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1響應(yīng)面分析因素水平的選取。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇濃度、超聲波時(shí)間和料液比3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化甘草浸膏中甘草酸的提取工藝，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1　試驗(yàn)因素和水平

2.3.2模型的建立。以甘草酸含量為響應(yīng)值(Y)，乙醇濃度X1、超聲波時(shí)間X2和料液比X3做如下變換[16]：xi=(Xi-X0)/X。式中，xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值；X為自變量的變化步長(zhǎng)。共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中，12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。甘草浸膏中甘草酸超聲提取中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，以甘草酸含量(Y)為因變量，乙醇濃度(x1)、超聲波時(shí)間(x2)和料液比(x3)為自變量，建立回歸方程：Y=8.15+0.17x1+0.076x2+0.13x3-0.05x1x2+0.10x1x3-0.022x2x3-0.094x12-0.38x2-0.20x32

方差分析結(jié)果表明，p模型<0.000 1，達(dá)極顯著水平，說(shuō)明該方程能夠正確反映甘草酸含量與乙醇濃度、超聲波時(shí)間和料液比之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)檢驗(yàn)p=0.218 7>0.05，不顯著，說(shuō)明該回歸方程與試驗(yàn)的擬合度較高。響應(yīng)值的變異系數(shù)CV為0.82%，較低，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信。模型Radj2=0.952 4，能解釋95.24%響應(yīng)值的變化，因此，該模型與實(shí)際擬合較好，可以用該模型對(duì)超聲波提取甘草浸膏中甘草酸工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從多項(xiàng)式擬合回歸方程模型因變量的方差分析可知，模型一次項(xiàng)x1、x3差異極顯著，x2差異顯著；交互項(xiàng)x1x3差異顯著，二次項(xiàng)x1差異顯著，x2、x3差異極顯著。由于各變量一次項(xiàng)的F值越大則說(shuō)明其對(duì)甘草酸提取的影響越顯著，可見各因素對(duì)甘草酸含量的影響程度由大到小依次為乙醇濃度、料液比、超聲波時(shí)間。

2.3.3響應(yīng)面分析及條件優(yōu)化。通過(guò)Design-ExpertV8.0.6對(duì)回歸結(jié)果做響應(yīng)面和等高線，結(jié)果見圖5～7。由圖5～7可知，乙醇濃度和料液比的交互影響最為顯著，乙醇濃度的影響比料液比更明顯；超聲波時(shí)間和料液比的交互作用最小，這與方差分析結(jié)果一致。

圖5　乙醇濃度和超聲波時(shí)間的交互作用Fig.5　Interaction between ethanol concentration and ultrasonic time

圖6　乙醇濃度和料液比的交互作用Fig.6　Interaction between ethanol concentration and solid-liquid ratio

圖7　超聲波時(shí)間和料液比的交互作用Fig.7　Interaction between ultrasonic time and solid-liquid ratio

通過(guò)軟件分析，回歸模型預(yù)測(cè)的甘草酸超聲提取的最佳工藝條件：乙醇濃度70%，超聲波時(shí)間30.52min，料液比2.79g/L，在此條件下甘草酸的理論含量為8.29%。

2.3.4驗(yàn)證試驗(yàn)。采用回歸模型所得的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，研究預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值的符合程度，從而判定模型是否穩(wěn)定可靠?？紤]到實(shí)際操作方便，將提取條件調(diào)整為乙醇濃度70%、超聲波時(shí)間30min、料液比2.8g/L，重復(fù)3次試驗(yàn)以減少誤差，所得甘草酸含量為8.34%，與理論預(yù)測(cè)值基本一致。可見基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)可靠準(zhǔn)確，重復(fù)性好，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

3結(jié)論

該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取甘草酸的工藝條件，建立了可良好預(yù)測(cè)甘草浸膏中甘草酸含量的模型，并獲得最佳提取工藝條件：乙醇濃度70%，超聲波時(shí)間30min，料液比2.8g/L，在此條件下甘草酸含量為8.34%，與預(yù)期值擬合度好。該工藝條件為甘草浸膏的精深加工及進(jìn)一步研究甘草酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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作者簡(jiǎn)介沈慧慧(1983- )，女，湖北仙桃人，工程師，碩士，從事進(jìn)出口食品和農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)分析。

收稿日期2016-04-08

中圖分類號(hào)S 567.7+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)13-167-04

Optimization of the Ultrasonic Extraction Technique of Glycyrrhizic Acid from Licorice Extract by Response Surface Method

SHEN Hui-hui, Aili·Aishan, WANG Wan-qiang et al

(Akesu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Akesu,Xinjiang 843000)

Abstract[Objective] To optimize the extraction technique for glycyrrhizic acid from licorice extract by response surface method (RSM).[Method] Based on the single factor tests on ethanol concentration,ultrasonic wave time and solid-liquid ratio,response surface method of three factors and three levels was adopted according to the Box-Behnken central composite design principle.The technological condition of glycyrrhizic acid was optimized by ultrasonic wave.[Result] The optimal extraction technology for glycyrrhizic acid was as follows:70%ethanol concentration,30 min ultrasonic time, 2.8 g/L solid-liquid ratio.Under this condition,the one-time extraction rate was 8.34%.[Conclusion] The optimal extraction technology for glycyrrhizic acid from licorice extract is established,which provides theoretical foundation for the intensive processing of extracts and the application of glycyrrhizic acid in food and medicine.

Key wordsResponse surface method(RSM); Glycyrrhizic acid; Ultrasonic extraction; Licorice extract