袁琴琴

(1．菏澤學院生命科學系，山東菏澤 274000；2．陜西師范大學藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西西安 710062)

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銀線草HPLC指紋圖譜研究

袁琴琴1，2

(1．菏澤學院生命科學系，山東菏澤 274000；2．陜西師范大學藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西西安 710062)

摘要[目的]建立銀線草HPLC指紋圖譜研究方法，為其質量控制提供依據。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex C18(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相甲醇-0.1%甲酸線性梯度洗脫，流速為 0.8 mL/min；檢測波長323 nm；柱溫25 ℃。[結果]建立了銀線草HPLC指紋圖譜共有模式，并標定12個共有峰，13批樣品指紋圖譜相似度在0.714～0.957。[結論]不同產地的銀線草化學成分存在一定差異，所建立的指紋圖譜方法簡單、準確可靠、重復性好，為銀線草質量標準的制定提供科學依據。

關鍵詞銀線草；HPLC；指紋圖譜

Key wordsChloranthusjaponicusSieb.; HPLC; Fingerprint

銀線草(ChloranthusjaponicusSieb.)為金粟蘭科金粟蘭屬多年生草本植物[1]，主產于我國黑龍江、遼寧、吉林、陜西、山西和甘肅等省，以根或全草入藥[2]，多生于海拔500～2 300 m的山坡、山谷雜木林下陰濕處或溝邊草叢中，喜富含腐殖質、濕潤而排水良好的土壤[3]。由于受產地、氣候和生態(tài)因子等的影響，不同產地的銀線草成分有一定差異，然而僅對其主要成分的含量進行測定不能有效地控制銀線草的質量。目前，指紋圖譜技術已成為控制中藥材質量的最重要手段之一，可以從整體上評價中藥材的質量[4-5]。筆者以13個主產區(qū)的銀線草為研究對象，選擇迷迭香酸為參照峰，構建銀線草HPLC的指紋圖譜，為銀線草質量標準的制定提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料2011年6～8月對陜西、吉林、遼寧及黑龍江4個主產省份的銀線草資源進行調查和收集，經陜西師范大學生命科學院田先華教授鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物銀線草(ChloranthusjaponicusSieb.)(表1)。

表1　銀線草樣品的來源

1.2儀器與試劑LC2010 AHT 高效液相色譜儀(日本島津公司)，SL202N 電子秤(賽多里斯科學儀器北京有限公司)，MILLI-Q 超純水儀器(MILLIPORE公司)，RE250AA 旋轉蒸發(fā)儀器(上海亞榮儀器公司)，KQ5200超聲波清洗器(江蘇昆山儀器有限公司)，DFT-50手提式粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，甲醇(美國Fisher公司，色譜純)，甲酸(天津市天力化學試劑有限公司，分析純)，所用水均為超純水。標準品：迷迭香酸(批號：07902PH，中國藥品生物制品檢定所)，色譜柱Phenomenex C18(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)(美國Phenomenex公司)。

1.3方法

1.3.1HPLC色譜條件。色譜柱采用Phenomenex C18(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相A：甲酸水，流動相B：甲醇；洗脫條件：0～5 min，甲醇15%～25%；5～20 min，甲醇25%～30%；20～45 min，甲醇30%～40%；45～95 min，甲醇40%～60%。流速0.8 mL/min，檢測波長323 nm，柱溫25 ℃，記錄時間95 min；進樣量10 μL。

1.3.2溶液的制備。

1.3.2.1對照品溶液的制備。精密稱取迷迭香酸對照品適量，溶于甲醇溶液，濃度為0.12 mg/mL，經0.22 μm濾膜過濾后作為對照品溶液備用。

1.3.2.2供試品溶液的制備。取銀線草粉末1.0 g，精密加5 mL 70%甲醇超聲提取30 min，提取2次，合并提取液，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得銀線草樣品溶液。

2結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1精密度。精密稱取S12號樣品(陜西寶雞紅河谷)粉末，按照“1.3.2.2”方法進行樣品提取，按照“1.3.1”的色譜條件進樣5次，通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算各色譜的相似度均大于0.92，以11號峰為參照峰，12個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3%，表明該儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.1.2穩(wěn)定性。取S13號樣品(陜西寶雞太白山)粉末，按照“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”的色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h進樣測定，所測得的色譜指紋圖譜無明顯變化，通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算各色譜的相似度均大于0.92。以11號峰為參照峰，12個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3%，表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.3重復性。準確稱取S13號樣品(陜西寶雞太白山)粉末5份，按“1.3.2.2”方法制備樣品溶液，按照“1.3.1”的色譜條件分別進樣，通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算各色譜的相似度均大于0.92。以11號峰為參照峰，12個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復性較好，符合指紋圖譜的要求。

2.2銀線草HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1銀線草指紋圖譜的測定。稱取13個地點的銀線草粉末1 g，按“1.3.2.2”的方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”的色譜條件依次將13批次銀線草樣品進行HPLC檢測，將13個銀線草指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)”進行色譜峰匹配，共有模式指紋圖譜中標定12個共有峰，構成銀線草指紋圖譜的特征峰，并得到共有模式對照指紋圖譜(圖1、2) 。

圖1　13批次銀線草樣品HPLC色譜Fig.1　The HPLC of 13 batches of Chloranthus japonicus Sieb.

圖2　共有模式對照指紋圖譜Fig.2　Fingerprint of common pattern

2.2.2銀線草指紋圖譜的技術參數?！吨袊幍洹?2010)規(guī)定金粟蘭科草珊瑚屬腫節(jié)風藥材質量評價標準為異秦皮啶和迷迭香酸，且含量不低于0.02%[6-7]，迷迭香酸在銀線草中含量較高，遠高于藥典規(guī)定的0.02%，且較穩(wěn)定，故選11號峰迷迭香酸為參照峰。利用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”，依據13批次銀線草供試品HPLC圖譜所給出的相關技術參數，通過色譜峰的自動匹配，確定了13批次供試品的12個共有峰，即為其共有指紋峰。迷迭香酸設為參照峰S，設置參照峰的保留時間和峰面積為1.000，計算出其他共有峰的相對峰面積和相對保留時間(表2、3)。

2.2.3相似度評價。將13批次銀線草的指紋圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”，以S2號批次(黑龍江省哈爾濱市帽兒山)圖譜為對照圖譜，使用中位數矢量法，生成了參照圖譜。選擇迷迭香酸這個共有峰作為校正的mark峰，生成13個產地的銀線草指紋圖譜。不同批次的銀線草指紋圖譜的相似度是以S2號銀線草的圖譜作為對照圖譜生成的參照圖譜，計算各指紋圖譜間的相對保留時間和相對峰面積與參照譜圖比較 。結果顯示，13個產地的銀線草樣品指紋圖譜具有較高的相似性，但也表現出一定差異，S4號吉林永吉縣雙河鎮(zhèn)、S5號吉林磐石市煙筒山、S7號吉林磐石市新發(fā)北山相似度較高，在0.944以上；S6號吉林磐石市大荒山、S12陜西省寶雞市紅河谷的相似度較低；其他批次的指紋圖譜相似度在0.816～0.897。

表2　銀線草共有蜂的相對保留時間

表3　銀線草共有蜂的相對峰面積

表4　不同產地銀線草指紋圖譜相似度

3結論與討論

該試驗對銀線草處理方法和HPLC色譜條件進行了優(yōu)化，對不同提取溶劑及濃度進行了篩選，結果以70%甲醇提

取效果較高。在提取方法上，比較了超聲與加熱回流以及不同提取時間，結果表明，采用超聲提取30 min提取效率較高。在流動相選擇上，比較了乙腈、甲醇與水、甲酸、醋酸、磷酸溶液等組合，確定以甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫效果最佳。在檢測波長選擇方面，采用DAD 檢測器于 200～400 nm 下檢測樣品，結果顯示，在 323 nm 下各峰有良好的吸收。

該研究采用HPLC方法，對陜西、黑龍江、吉林和遼寧4個主產省份銀線草藥材的指紋圖譜進行了研究。以迷迭香酸為參照峰，13批次銀線草的特征指紋圖譜中有12個共有峰，盡管共有峰的保留時間相對穩(wěn)定，但相對峰面積卻有一定的差異，表現為各產地銀線草藥材的相似度降低。表明不同產地的銀線草成分存在一定差異，可能由于藥材受氣候、海拔、產地、經緯度等生態(tài)因子的影響。

該研究以穩(wěn)定性、精密度和重現性為依據，考查了銀線草指紋圖譜的方法學，結果表明，主要峰的相對峰面積以及相對保留時間的RSD值均低于3%，說明該方法適用于建立銀線草指紋圖譜，且系統(tǒng)穩(wěn)定，符合中藥指紋圖譜建立的技術要求。運用相似度評價軟件對銀線草指紋圖譜的相似度進行計算，發(fā)現13個產地的銀線草指紋圖譜存在一定差異，S4號吉林永吉縣雙河鎮(zhèn)、S5號吉林磐石市煙筒山、S7號吉林磐石市新發(fā)北山相似度很高，在0.944以上；S6吉林磐石市大荒山、S12陜西省寶雞市紅河谷的相似度較低；其他批次的指紋圖譜相似度在0.816～0.897。

該研究建立的HPLC方法能夠適用于銀線草的指紋圖譜分析，符合中藥指紋圖譜建立的要求，為銀線草質量標準的建立提供科學依據。

參考文獻

[1] 周浙昆.金粟蘭科的起源、演化及其分布[J].云南植物研究，1993，15(4)：321.

[2] 陳海山，程用謙.金粟蘭科的起源、分化和地理分布研究[J].熱帶亞熱帶植物學報，1994，2(4)：31.

[3] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1982：79-80.

[4] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術與應用[J].中國中藥雜志，2001，21(10)：653-655.

[5] 馬虹，韋永勤，林佳任.中藥指紋圖譜的研究及進展[J].貴陽中醫(yī)學院學報，2004，26(2)：58-59.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典：一部 [S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[7] 吳建章，郁建平，趙東亮.迷迭香酸的研究進展[J].天然產物研發(fā)，2005，17(3)：383-388．

基金項目西安市科技創(chuàng)新支撐計劃項目[CXY1018(3)]；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目(CK201002010)。

作者簡介袁琴琴(1986- )，女，山東菏澤人，助教，碩士，從事植物生物技術研究。

收稿日期2016-03-26

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-138-03

HPLC Fingerprint ofChloranthusjaponicusSieb.

YUAN Qin-qin1，2

(1. Department of Life Science, Heze University, Heze, Shandong 274000; 2. Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education, National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drug in Northwest of China, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710062)

Key words[Objective] To establish a method of HPLC fingerprint analysis on Chloranthus japonicus Sieb., and to provide references for the quality control. [Method] High-performance liquid chromatography was adopted. The chromatographic column was Phenomenex C18(250.0 mm × 4.6 mm, 5.0 μm); mobile phase was methanol-0.1% formic acid with linear gradient elution; flow rate was 0.8 mL/min; detection wavelength was 323 nm and the column temperature was maintained at 25 ℃. [Result] HPLC fingerprint of C. japonicus was established. Twelve main marker peaks were selected. Fingerprint similarities of 13 sample batches were distributed between 0.714 and 0.957. [Conclusion] There are certain differences in the chemical components of C. japonicus in different production areas. The established fingerprint method is simple, accurate, reliable and repeatable, which provides scientific references for the quality standard establishment of C. japonicus.