馬開富，孫　凱，孫炳偉

(襄陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 襄陽(yáng)　441021 )

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急性腦梗死阿司匹林抵抗患者血小板miR-19a表達(dá)變化及臨床意義

馬開富，孫凱，孫炳偉

(襄陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 襄陽(yáng)441021 )

摘要：目的探討急性腦梗死阿司匹林抵抗患者血小板miR-19a表達(dá)變化及臨床意義。方法選取急性腦梗死患者137例，收集臨床資料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血小板中miR-19a表達(dá)，利用血小板聚集實(shí)驗(yàn)判別阿司匹林抵抗(AR)和非AR，利用Kaplan-Meier法對(duì)AR和非AR無終點(diǎn)事件生存時(shí)間進(jìn)行比較。結(jié)果137例急性腦梗死患者中，38例(27.7%)發(fā)生AR，99例(72.3%)為非AR；AR患者血小板中miR-19a相對(duì)表達(dá)量為(1.42±0.15)，顯著高于非AR患者血小板中miR-19a相對(duì)表達(dá)量(1.16±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.833，P<0.001)；多因素Logistic回歸分析顯示，miR-19a相對(duì)表達(dá)量上升和合并2型糖尿病是影響AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=5.13和1.48，P<0.05)；AR患者中9例(23.7%)發(fā)生終點(diǎn)事件，而非AR患者中僅有7例(7.1%)發(fā)生終點(diǎn)事件，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.348，P=0.007)，Kaplan-Meier生存分析顯示，AR患者無終點(diǎn)事件中位時(shí)間146.8d，非AR患者無終點(diǎn)事件中位時(shí)間169.6d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.531，P=0.006)。結(jié)論AR患者血小板中miR-19a表達(dá)上調(diào)，是影響AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并可能影響患者預(yù)后。

關(guān)鍵詞：腦梗死;微Rnas;血小板聚集;阿司匹林抵抗

近年來隨著老齡化進(jìn)程加快及人們生活方式改變，急性腦梗死發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重危害人類健康。研究表明[2]，血小板活化、聚集、黏附在腦血管血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用?？寡“寰奂咽桥R床上常規(guī)治療急性腦梗死的治療手段[3]，其中，阿司匹林是最為常用的藥物，在腦血管病預(yù)防及治療中廣泛應(yīng)用，然而，臨床發(fā)現(xiàn)部分患者在治療過程中會(huì)出現(xiàn)阿司匹林抵抗(aspirinresistance，AR)，增加了復(fù)發(fā)缺血性事件的風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前，AR發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚，研究表明[5]，微小RNA(miRNA)作為機(jī)體內(nèi)調(diào)控多種生物學(xué)功能的非編碼RNA，在血小板形成、成熟、活化等過程中亦發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。miR-19a作為miRNA重要類型，在白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[6]。本研究擬對(duì)接受阿司匹林治療的急性腦梗死患者血小板中miR-19a表達(dá)變化進(jìn)行分析，探討其在AR發(fā)生中的意義，以期為臨床實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2014年3月至2015年9月在襄陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性腦梗死患者137例，其中男性82例，女性55例，年齡42～78歲，平均年齡(63.8±10.5)歲，病例入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合1995年全國(guó)腦血管病會(huì)議制定的《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》標(biāo)準(zhǔn)[7]，并經(jīng)臨床和CT等影像學(xué)檢查確診；(2)均為首次發(fā)病，發(fā)病時(shí)間在72h以內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有心血管動(dòng)脈粥樣硬化、梗阻性疾病、動(dòng)脈炎及動(dòng)脈瘤者；(2)腦出血及栓死后再發(fā)出血者；(3)血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤患者；(4)重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；(5)近一月內(nèi)有外科手術(shù)史者、使用影響血小板功能藥物者；(6)具有阿司匹林口服禁忌證者。所有患者于入院后開始頓服阿司匹林腸溶片100mg·d-1(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H15020766，生產(chǎn)企業(yè)：呼倫貝爾康益藥業(yè)有限公司)。本研究經(jīng)襄陽(yáng)市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和設(shè)備Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，miR-19a及內(nèi)參引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，花生四烯酸和二磷酸腺苷購(gòu)自美國(guó)Helena公司，ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)BeckmanCoulter公司，全自動(dòng)血小板聚集儀購(gòu)自上海博士?jī)x器有限公司。

1.3觀察指標(biāo)觀察所有患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、煙酒嗜好、高血壓和2型糖尿病患病等一般臨床資料，以及血糖、血脂、血小板計(jì)數(shù)、平均血小板體積、血小板比積等生化檢測(cè)指標(biāo)。

1.4標(biāo)本采集及處理所有患者于服用阿司匹林10d時(shí)，留取晨起空腹靜脈血6mL，分裝于兩支抗凝管中，一支用于提取血小板，枸緣酸鈉抗凝，于1 000r·min-1(半徑8cm)離心10min，留取上層富血小板血漿，再次于3 500r·min-1進(jìn)行離心30min，留取沉淀，加入RNAlater，保存于-70 ℃冰箱以備檢；另一支用于檢測(cè)血小板聚集率，于30min內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)操作。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血小板中miR-19a表達(dá)取血小板沉淀，加入細(xì)胞裂解液裂解后，利用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取并檢測(cè)純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得模板鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR試劑盒完成PCR。miR-19a及內(nèi)參引物：miR-19a引物：上游：5’-GCAAATCTATGCAAAAC-3’，下游：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6引物：上游：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，下游：5’-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3’。PCR反應(yīng)條件：92 ℃ 2min，92 ℃ 60s，56 ℃ 30s，76 ℃ 30s，連續(xù)進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置三個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。以2-△△Ct法獲得血小板中miR-19a相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2利用血小板聚集實(shí)驗(yàn)判別AR和非AR取靜脈血，于1 000r·min-1進(jìn)行離心10min，取上層富含血小板血漿，并計(jì)數(shù)血小板數(shù)量，取下層剩余血液再次于3 000r·min-1進(jìn)行離心15min，留取乏血小板血漿，并用乏血小板血漿對(duì)富血小板血漿進(jìn)行調(diào)整，使血小板數(shù)量在360×109·L-1。分別取富含血小板血漿和乏血小板血漿置于全自動(dòng)血小板聚集儀反應(yīng)杯中，于37 ℃下，攪拌棒攪拌溫浴5min。分別加入誘導(dǎo)劑花生四烯酸和二磷酸腺苷，檢測(cè)血小板聚集程度，根據(jù)文獻(xiàn)[8]標(biāo)準(zhǔn)，將花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集率≥20%或二磷酸腺苷誘導(dǎo)血小板聚集率≥70%作為AR。

1.6隨訪所有患者于出院后繼續(xù)口服阿司匹林腸溶片100mg·d-1，利用門診或電話對(duì)患者進(jìn)行隨訪，時(shí)間為6個(gè)月，將死亡、腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、心肌梗死作為終點(diǎn)事件。

2結(jié)果

2.1AR發(fā)生情況137例急性腦梗死患者中，38例(27.7%)發(fā)生AR，99例(72.3%)為非AR。

2.2AR和非AR患者一般資料比較兩組患者在年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、高血壓比例、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血小板計(jì)數(shù)、血小板比積和平均血小板體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AR患者2型糖尿病比例和空腹血糖水平均高于非AR患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3AR和非AR患者血小板中miR-19a表達(dá)AR患者血小板中miR-19a相對(duì)表達(dá)量為(1.42±0.15)，非AR患者血小板中miR-19a相對(duì)表達(dá)量為(1.16±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.833，P<0.001)。

2.4AR發(fā)生相關(guān)影響因素Logistic回歸分析以是否發(fā)生AR為因變量，以一般臨床資料、生化檢測(cè)指標(biāo)和miR-19a為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-19a相對(duì)表達(dá)量上升和合并2型糖尿病是影響AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=5.13和1.48，P<0.05)。

表1　AR和非AR患者一般資料比較

2.5AR和非AR患者隨訪中終點(diǎn)事件發(fā)生情況兩組患者在隨訪期間均未出現(xiàn)失訪病例，AR患者中9例(23.7%)發(fā)生終點(diǎn)事件，而非AR患者中僅有7例(7.1%)發(fā)生終點(diǎn)事件，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.348，P=0.007)。Kaplan-Meier生存分析顯示，AR患者無終點(diǎn)事件中位時(shí)間146.8d，非AR患者無終點(diǎn)事件中位時(shí)間169.6d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Logrank檢驗(yàn)：χ2=7.531，P=0.006)，見圖1。

圖1　AR和非AR患者無終點(diǎn)事件生存時(shí)間分析

3討論

急性腦梗死作為神經(jīng)內(nèi)科常見病和多發(fā)病，病因多樣、發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其中，血小板活化是血栓形成的重要病理基礎(chǔ)，阿司匹林作為臨床上常用的抑制血小板活化的藥物，可通過不可逆的抑制環(huán)氧酶-1而抑制血小板活化、聚集，從而降低心腦血管血栓性疾病的發(fā)生[9]。然而，急性腦梗死患者在接受阿司匹林治療過程中約有11%～46%出現(xiàn)AR而影響治療效果[10]。本研究顯示，137例急性腦梗死患者在進(jìn)行阿司匹林治療過程中，38例發(fā)生AR，發(fā)生率27.7%，進(jìn)一步說明AR在急性腦梗死患者中有較高發(fā)生率。

miRNA作為具有多種生物學(xué)功能的非編碼短小RNA，廣泛存在于生物體內(nèi)，研究表明[11]，血小板活化時(shí)會(huì)出現(xiàn)多種miRNA表達(dá)變化。miR-19a作為miR-17-92家族重要成員，參與調(diào)控了血管發(fā)生及穩(wěn)態(tài)，并在血細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[12]。本研究顯示，AR患者血小板中miR-19a相對(duì)表達(dá)量顯著高于非AR患者，說明miR-19a可能參與了AR的發(fā)生。本研究顯示，AR和非AR一般臨床資料和生化指標(biāo)無差異，但AR患者中2型糖尿病比例和空腹血糖水平均高于非AR患者，說明糖尿病是影響AR的因素，與陳哲等[13]研究結(jié)論相同。多因素Logistic回歸分析顯示，miR-19a相對(duì)表達(dá)量上升和合并2型糖尿病是影響AR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=5.13和1.48，P<0.05)，說明miR-19a表達(dá)上調(diào)是引發(fā)AR發(fā)生的影響因素。在對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪中發(fā)現(xiàn)，AR患者中終點(diǎn)事件發(fā)生率23.7%，顯著高于非AR患者的7.1%，Kaplan-Meier生存分析顯示，AR患者無終點(diǎn)事件中位時(shí)間146.8d，低于非AR患者的169.6d，說明AR是影響急性腦梗死患者不良終點(diǎn)事件發(fā)生的危險(xiǎn)因素，同時(shí)，亦進(jìn)一步提示miR-19a可能通過影響AR的發(fā)生而影響患者預(yù)后。

綜上所述，AR患者血小板中miR-19a表達(dá)量上調(diào)，是影響AR發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而AR是影響患者不良終點(diǎn)事件的危險(xiǎn)因素，提示miR-19a可通過影響AR而影響患者預(yù)后，因此，miR-19a有望成為早期發(fā)現(xiàn)AR及預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]QuinnCT.Breakthrough:newguidanceforsilentcerebralischemiaandinfarctioninsicklecelldisease[J].HematologyAmSocHematolEducProgram,2014,2014(1):438-443.

[2]ZhuW,GregoryJC,OrgE,etal.GutmicrobialmetaboliteTMAOenhancesplatelethyperreactivityandthrombosisRisk[J].Cell,2016,165(1):111-124.

[3]中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)卒中預(yù)防與控制專業(yè)委員會(huì)介入學(xué)組.缺血性腦血管病介入治療抗血小板策略中國(guó)專家共識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2015,95(11):803-809.

[4]林志堅(jiān),車秀娟,程欣,等.腦梗死患者阿司匹林抵抗與復(fù)發(fā)缺血性血管事件風(fēng)險(xiǎn)[J].卒中與神經(jīng)疾病,2015,22(3):148-151.

[5]丁雪燕,宋曉偉,荊清,等.MicroRNA在血小板產(chǎn)生和激活中的作用[J].國(guó)際心血管病雜志,2013,40(3):161-177.

[6]于宇,張淑蘭.miR-17-92 基因簇研究進(jìn)展[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2014,41(2):124-127.

[7]中華神經(jīng)學(xué)會(huì)，中華神經(jīng)外科學(xué)會(huì).各類腦血管病診斷要點(diǎn)[J].中華神經(jīng)內(nèi)科雜志,1996,29(6):379-380.

[8]黃亞,閆福嶺.阿司匹林抵抗研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,34(3):459-462.

[9]ZhangQ,WangC,ZhengM,etal.Aspirinplusclopidogrelassecondarypreventionafterstrokeortransientischemicattack:asystematicreviewandmeta-analysis[J].CerebrovascDis,2015,39(1):13-22.

[10]CaiG,ZhouW,LuY,etal.Aspirinresistanceandotheraspirin-relatedconcerns[J].NeurolSci,2016,37(2):181-189.

[11]McManusDD,FreedmanJE.MicroRNAsinplateletfunctionandcardiovasculardisease[J].NatRevCardiol,2015,12(12):711-717.

[12]ConcepcionCP,BonettiC,VenturaA.ThemicroRNA-17-92familyofmicroRNAclustersindevelopmentanddisease[J].CancerJ,2012,18(3):262-267.

[13] 陳哲,苗莉,張鵬睿,等.高同型半胱氨酸血癥對(duì)老年糖尿病患者阿司匹林抵抗的影響[J].中國(guó)糖尿病雜志,2015,23(11):1003-1006.

基金項(xiàng)目:江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院面上項(xiàng)目(BK2012703)

通信作者：孫凱，女，副主任醫(yī)師，研究方向：免疫檢驗(yàn)，E-mail：1879469320@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.030

(收稿日期：2016-04-06,修回日期：2016-04-26)