賀方智，張　濤，楊亞榮，梁蓬勃，李瑞娜

(1.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安　710003;2.西安市兒童醫(yī)院南區(qū)小兒內(nèi)科門診，陜西 西安　710054)

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轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20對小兒遺傳代謝性肝病的影響及可能機制

賀方智1，張濤2，楊亞榮1，梁蓬勃1，李瑞娜1

(1.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安710003;2.西安市兒童醫(yī)院南區(qū)小兒內(nèi)科門診，陜西 西安710054)

摘要：目的探討垂體ZBTB20轉(zhuǎn)錄因子對小兒遺傳代謝性肝病影響及可能的機制。方法通過免疫熒光化學方法檢測不同發(fā)育階段小兒遺傳代謝性肝病的血細胞ZBTB20表達情況；采用Real time PCR和Western blot檢測小兒遺傳代謝性肝病患兒5種激素(GH、PRL、LH、FSH、TSH)的mRNA、蛋白水平。結(jié)果小兒在出生15 d的時候可以檢測到ZBTB20蛋白的表達，一直延續(xù)到出生后很久；ZBTB20陽性細胞在大部分的垂體內(nèi)分泌細胞中存在；催乳素的mRNA及蛋白表達在小兒遺傳代謝性肝病中檢測不出，生長激素 mRNA及蛋白表達在小兒遺傳代謝性肝病中的表達量為對照組的一半，差異有統(tǒng)計學意義，mRNA及蛋白水平在其它3種促激素中表達沒有明顯改變。結(jié)論ZBTB20是調(diào)控小兒遺傳代謝性肝病發(fā)病過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，在腺垂體內(nèi)分泌細胞廣泛表達，其缺失可導致腺垂體的發(fā)育不全。

關(guān)鍵詞：代謝缺陷,先天性；轉(zhuǎn)錄因子；肝；垂體；兒童

垂體是人體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分之一，對維系小兒出生后內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的作用，由于其過程是一個高度精確復雜的過程，受到不同的信號通路及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，在任何環(huán)節(jié)中出問題都可以導致發(fā)育出現(xiàn)異常，進而導致內(nèi)分泌的紊亂[1-2]。肝臟是人體內(nèi)各種物質(zhì)代謝的主要器官，各種內(nèi)分泌引起的遺傳性缺陷可誘發(fā)代謝通路阻斷，進而導致以肝臟病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的代謝性疾病。隨著垂體發(fā)育研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)垂體重要轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20與代謝性肝病具有一定的相關(guān)性，但是其分子機制還尚未完全明確[3]。表型的多樣性以及伴隨激素的缺失，不是僅通過一些信號分子和轉(zhuǎn)錄因子單純作用可以解釋的，更多的參與小兒遺傳代謝性肝病的相關(guān)調(diào)控因素還需要進一步的探索[4-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)ZBTB20轉(zhuǎn)錄因子對于小兒遺傳代謝性肝病起到關(guān)鍵性作用[7]。本研究進一步探討ZBTB20轉(zhuǎn)錄因子在小兒遺傳代謝性肝病發(fā)病過程中的生理機制，深入了解其相關(guān)分子調(diào)控機制，為小兒遺傳代謝性肝病的發(fā)病原因及臨床診治提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1主要試劑、細胞與儀器受試者：小兒遺傳代謝性肝病患兒20例，主要包括碳水化合物代謝病2例、氨基酸代謝病3例、脂肪酸代謝病5例、有機酸代謝病2例、線粒體肝病2例、溶酶體病3例、過氧化物酶體病1例、金屬代謝障礙1例及α1-抗胰蛋白酶缺乏癥1例。小兒遺傳代謝性肝病的診斷采用基因檢測技術(shù)，以Arg778Leu 突變?yōu)樵\斷標準。本研究中所有納入患兒均出現(xiàn)了該基因型突變。另取正常新生兒20例為對照組，所有患者參加研究前均知情同意，且本研究獲得西安市兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準。

試劑：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國 Invitroge 公司)，TaqMix(東盛生物公司)，PCR試劑盒(上海碩盟生物)，免疫組化試劑盒(武漢博士德)，HRP標記山羊抗小鼠IgG，HRP標記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)，一抗：GH、PRL、LH、FSH、TSH、ACTH、ZBTB20抗體 (美國Santa Cruz公司)。

儀器：倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，高速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，-80～4 ℃冰箱(日本松下)，高壓消毒箱(美國Tuttnauer)，轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀(美國伯樂公司)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)。

1.2免疫熒光化學方法檢測了ZBTB20在不同發(fā)育階段小兒遺傳代謝性肝病中的表達情況采用的是組織免疫熒光法進行檢測，抽取受試患兒的血清，依據(jù)胞漿抗原或者核抗原的修復條件而選用相應(yīng)的修復液進行抗原修復，體積分數(shù)3%的雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶15 min，50 μL非免疫動物血清封閉，加第一抗過夜，50 μL生物素標記第二抗體，辣根過氧化物酶孵育，DBA顯色，熒光染料37 ℃避光孵育30 min，DAPI室溫避光孵育5 min，熒光顯微鏡下觀察后拍片。

1.3免疫熒光化學雙標的方法進一步檢測了ZBTB20在垂體不同內(nèi)分泌細胞中的分布經(jīng)過脫蠟水合以后，加入相應(yīng)的修復液進行抗原修復。3%的雙氧水用PBS稀釋后，于25 ℃進行內(nèi)源性的過氧化物酶滅活，時間為20 min。時間到后PBS每3 min洗3次?？贵w兩種混合在一起,孵育4 ℃20 h之后，第一種抗體的二抗孵育35 min，生物素孵育15 min，加第一種熒光染料CY3(紅色)。同樣加入第二種抗體Hoechst33258(藍色)的二抗孵育，生物素常溫孵育15 min，加入第二種熒光染料，通過熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果后拍照。

1.4Realtime PCR法檢測了5種促激素的mRNA水平取受試者血清，加入1 mL Trizol，按照Trizol說明書提取總RNA，取2 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，取20 μL作為反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL以及18 s RNA和AQP3的引物共同組成。反應(yīng)過程按照標準的RT-PCR步驟進行：首先預變性的反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，接著進行梯度變性反應(yīng)，94 ℃、30 s;60 ℃、30 s;72 ℃、60 s;72 ℃、7 min遞減，共進行30次的循環(huán)。接著對所得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍攝電泳圖像對所得到的電泳結(jié)果進行凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內(nèi)參選擇18 s RNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對得到的半定量結(jié)果進行對比分析，通過量化的吸光度積分值進行分析(A值)，見表1。

1.5Western blot檢測了5種促激素的蛋白水平提取受試者血清蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h。ECL光化學法顯色，用彩色圖像分析系統(tǒng)測定吸光度。

2結(jié)果

2.1免疫熒光化學方法檢測了ZBTB20在不同發(fā)育階段小兒遺傳代謝性肝病中的表達情況免疫熒光化學檢測結(jié)果顯示不同發(fā)育階段小兒遺傳代謝性肝病血清學中的表達情況，在第15天的時候可以檢測到ZBTB20蛋白的表達，30、60 d的時候，ZBTB20陽性細胞數(shù)顯著增加，一直延續(xù)到90 d檢測到小兒遺傳代謝性肝病血清中均維持有廣泛的ZBTB20表達，見圖1。

2.2免疫熒光化學雙標的方法進一步檢測了ZBTB20在垂體不同內(nèi)分泌細胞中的分布第15天檢測ZBTB20在垂體不同內(nèi)分泌細胞(嗜酸性細胞、嗜堿性細胞、嫌色細胞)中的分布，免疫熒光化學檢測結(jié)果顯示6種不同的激素均存在共表達情況，ZBTB20陽性細胞大部分的垂體內(nèi)分泌細胞中存在，說明ZBTB20在腺垂體內(nèi)分泌細胞廣泛表達，見圖2。

2.3Real time PCR法檢測了5種促激素的mRNA水平Real time PCR法檢測結(jié)果顯示，催乳素的mRNA表達在小兒遺傳代謝性肝病血清中檢測不出，生長激素 mRNA表達在小兒遺傳代謝性肝病血清中的表達量為對照組的一半，mRNA水平在其它3種促激素中表達沒有明顯改變，見表2。

2.4Western blot檢測了5種促激素的蛋白水平我們相應(yīng)地也檢測了各激素的蛋白表達水平的情況，結(jié)果與mRNA水平的結(jié)果相似，見表3。

表3　Western blot檢測了5種促激素的蛋白水平

3討論

垂體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在小兒重要臟器發(fā)育中起著重要的作用，其中在小兒遺傳代謝性肝病的發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用，肝臟的發(fā)育是一個高度精確性過程，任意環(huán)節(jié)出了問題都會導致發(fā)育不全等問題[8]。本課題的研究結(jié)果可見垂體發(fā)育的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZBTB20在第15天的時候可以檢測到ZBTB20蛋白的表達，30、60 d的時候，ZBTB20陽性細胞數(shù)顯著增加，一直延續(xù)到90 d檢測到小兒遺傳代謝性肝病血清中均維持有廣泛的ZBTB20表達，ZBTB20陽性細胞數(shù)顯著增加，可達到較高的表達豐度。同時研究發(fā)現(xiàn)這兩天也是生長激素和催乳素等激素分化的時間，因此ZBTB20陽性細胞開始出現(xiàn)在這兩種激素細胞分化之前，也提示了ZBTB20參與了這兩群細胞的分化過程，對維持垂體的功能和小兒遺傳代謝性肝病的發(fā)病發(fā)揮著重要的作用[9-11]。

垂體的發(fā)育在胚胎時期及內(nèi)分泌細胞的分化過程和分泌細胞的擴增階段都存在，胚胎期的小兒遺傳代謝性肝病受到了多種信號通路及轉(zhuǎn)錄因子的影響，對于不同生長階段的內(nèi)分泌細胞也同樣有此效應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果可以看到催乳素的mRNA及蛋白表達在小兒遺傳代謝性肝病血清中檢測不出，生長激素 mRNA及蛋白表達在小兒遺傳代謝性肝病血清中的表達量為對照組一半左右，mRNA及蛋白水平在其它3種促激素中表達沒有明顯改變。提示小兒遺傳代謝性肝病血清中生長激素的表達減少，其可能的機制是位于下丘腦的正調(diào)節(jié)信號的減弱或者是負調(diào)節(jié)信號的增強誘發(fā)的，而不是垂體組織本身對基因敲除所直接因素導致的[14]。本研究的結(jié)果從一定程度上說明了生長激素和催乳素細胞在小兒遺傳代謝性肝病發(fā)病控制中的重要性。生長激素和催乳素能夠相互轉(zhuǎn)化就目前研究還存在著爭議，之前的研究結(jié)果認為生長激素及催乳素細胞之間可以存在相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系[15-16]。我們通過本研究，在人類的腺垂體第15天或者第16天的時候已經(jīng)可以確定催乳素的存在，也還可以看到這些細胞群是由催乳素和生長激素的陽性細胞組成，推測其最終的分化目標還是受到細胞內(nèi)環(huán)境及周圍外環(huán)境的影響。

圖1免疫熒光化學方法檢測了ZBTB20在小兒遺傳代謝性肝病血清學中的表達情況(×100)

圖2免疫熒光化學雙標的方法進一步檢測了ZBTB20在垂體不同內(nèi)分泌細胞中的分布(×100)

綜上所述，本研究證實了ZBTB20是調(diào)控小兒遺傳代謝性肝病發(fā)病過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，在腺垂體內(nèi)分泌細胞廣泛表達，其缺失可導致腺垂體的發(fā)育不全。ZBTB20在垂體中的缺失可導致GH、PRL分化出現(xiàn)障礙。未來可以靶向針對這一轉(zhuǎn)錄因子采取相應(yīng)的干預措施，幫助我們進一步從垂體調(diào)控方面治療小兒遺傳代謝性肝病，對小兒遺傳代謝性肝病的診斷及治療具有重要的指導價值，值得深入研究。

參考文獻

[1]Franceschi R,Rozzanigo U,Failo R,et al.Pituitary hyperplasia secondary to acquired hypothyroidism: case report[J].Ital J Pediatr,2011，37(1):1-4.

[2]Baranowski E,Hoegler W.An unusual presentation of acquired hypothyroidism:the Van Wyk-Grumbach syndrome[J].Eur J Endocrinol,2012，166(3):537-542.

[3]羅小平,王天有.從戈謝病的診療現(xiàn)狀看我國罕見病的未來之路[J].中華兒科雜志,2015,53(4):254-255.

[4]Skarnes WC,Rosen B,West AP,et al.A Conditional Knockout Resource for the Genome-Wide Study of Mouse Gene Function[J].Nature,2011,474(7351):337-342.

[5]潘琦偉，朱惠娟，龔鳳英，等.兒童青少年垂體柄中斷綜合征的鞍區(qū)磁共振影像特征[J].中國醫(yī)學科學院學報,2011,33(1):9-13.

[6]Iorgi ND,Napoli F,Allegri AE,et al.Diabetes insipidus-diagnosis and management[J].Horm Res Paediatr,2012,77(2):69-84.

[7]Harrington J,Palmert MR.Clinical review:Distinguishing constitutional delay of growth and puberty from isolated hypogonadotropic hypogonadism:critical appraisal of available diagnostic tests[J].J Clin Endocrinol Metab,2012,97(9):3056-3067.

[8]彭小蓉,許紅梅.原發(fā)性線粒體功能障礙與肝臟疾病[J].中華肝臟病雜志,2013,21(7):551-553.

[9]Kalina MA,Kalina-Faska B,Gruszczynska K,et al.Usefulness of magnetic resonance findings of the hypothalamic-pituitary region in the management of short children with growth hormone deficiency: evidence from a longitudinal study[J].Childs Nerv Syst,2012,28(1):121-127.

[10] 王立娟,管小琴.小兒遺傳代謝性肝病的臨床病理分析[J].臨床兒科雜志,2010,28(6):565.

[11] 羅小平,吳薇.重視和加強新生兒遺傳代謝病的篩查[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學雜志,2015,18(3):168-171.

[12] Zacharin M,Sabin MA,Nair VV,et al.Addition of recombinant follicle-stimulating hormone to human chorionic gonadotropin treatment in adolescents and young adults with hypogonadotropic hypogonadism promotes normal testicular growth and may promote early spermatogenesis[J].Fertil Steril,2012,98(4):836-842.

[13] Zarrilli F,Elce A,Scorza M,et al.An update on laboratory diagnosis of liver inherited diseases[J].Biomed Res Int,2013,2013:697940.

[14] Di IN,Allegri AE，Napoli F,et al.The use of neuroimaging for assessing disorders of pituitary development[J].Clin Endocrinol(Oxf),2012，76(2):161-176.

[15] Tsai SL,Laffan E,Lawrence S.A retrospective review of pituitary MRI findings in children on growth hormone therapy[J].Pediatr Radiol,2012，42(7):799-804.

[16] Cabrera SM,Dimeglio LA,Eugster EA.Incidence and characteristics of pseudoprecocious puberty because of severe primary hypothyroidism[J].The Journal of Pediatrics,2013，162(3):637-639.

Study on the pathogenesis of inherited metabolic liver disease in children based on transcription factor ZBTB20

HE Fang-zhi1,ZHANG Tao2,YANG Ya-rong1,et al

(1.Xi′anChildren′sHospital,Shaanxi,Xi′an710003;2.SouthernDistrictofXi′anChildren′sHospital,Shaanxi,Xi′an710054)

Abstract:ObjectiveThis study investigated the inherited pediatric pituitary metabolic liver disease and its possible mechanism based on ZBTB20 transcription factor.MethodsThe expressions of ZBTB20 at different developmental stages in the blood cells of children with inherited metabolic diseases were detected by immunofluorescence staining.;mRNAs of 5 hormones of pediatric inherited metabolic liver disease(GH,PRL,LH,FSH,TSH ) along with the protein levels were detected using Real time PCR and Western blot.ResultsThe expression of ZBTB20 protein can be detected on the 15th day after birth,and the expression also lasted for quite a long time.ZBTB20 positive cells were present in most of the pituitary endocrine cells.Expressions of prolactin mRNA and protein were undetectable,while expressions of growth hormone mRNA and protein were observed,the levels of which were about half of the control group,The difference was statistically significant.It was also found that mRNA and protein levels in the other three kinds of trophic hormone did not change significantly.ConclusionsThis study confirms ZBTB20 is an important transcription factor involved in the pathogenesis of pediatric inherited metabolic liver disease.It is widely expressed in pituitary endocrine cells,which can lead to hypoplasia of pituitary.

Key words:Metabolism,inborn errors;Transcription factors;Liver;Pituitary gland;Child

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.023

(收稿日期：2016-01-27，修回日期：2016-03-23)