閆　瀅，李　明，胡　冰，何義富

(安徽省立醫(yī)院西區(qū)　安徽省腫瘤醫(yī)院,a.腫瘤內(nèi)一科,b.檢驗科，安徽 合肥　230031)

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◇臨床醫(yī)學◇

晚期非小細胞肺癌乳頭瘤病毒感染狀況及其與P16表達的關聯(lián)性研究

閆瀅a，李明b，胡冰a，何義富a

(安徽省立醫(yī)院西區(qū)安徽省腫瘤醫(yī)院,a.腫瘤內(nèi)一科,b.檢驗科，安徽 合肥230031)

摘要：目的探討晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)人乳頭瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)感染狀況及其與P16的相關性研究。方法收集83例臨床確診的晚期NSCLC患者石蠟包埋組織標本，采用Luminex液相芯片技術對所有標本進行HPV基因分型，免疫組化法檢測P16表達情況。收集患者臨床病理資料，分析HPV感染和P16表達對患者無進展生存期(progression-free survival，PFS)的影響。結果83例晚期NSCLC患者組織中HPV感染率為24%(20/83)，HPV感染主要發(fā)生在非吸煙者、淋巴結不轉(zhuǎn)移者和分化程度較差者(P=0.048，P=0.044，P=0.024)。40%的HPV感染腫瘤組織P16表達陽性。多因素分析發(fā)現(xiàn)分化程度差(odds ratio=0.163) 是HPV感染的獨立預測因子。P16陽性患者較P16陰性患者具有更長的PFS(P<0.023)。結論研究結果表明P16蛋白表達與HPV感染無相關性，但P16蛋白表達可能是晚期NSCLC具有較長生存期的獨立預測因子。

關鍵詞：癌,非小細胞肺；乳頭狀瘤病毒科；周期素依賴激酶抑制劑P16

肺癌已成為全世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占85%左右。NSCLC的發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳因素密切相關[1]，其中吸煙、環(huán)境污染、放射性污染是NSCLC發(fā)生的主要因素。然而，并不是所有肺癌的發(fā)生都與上述因素相關，HPV感染被認為是肺癌發(fā)生的潛在影響因素之一[2]。許多研究報道，在肺癌組織中存在著較高的HPV感染檢出率，但目前由于存在檢測方法的差異、地域差異和標本類型的差異，肺癌組織中HPV檢出率差異較大，且HPV感染引起肺癌發(fā)生發(fā)展的機制尚未得到闡明，致使HPV感染與肺癌的相關性存在一定爭議[3-4]。

P16是一種細胞周期依賴性蛋白酶抑制劑，能抑制腫瘤細胞抑制因子視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白的磷酸化，導致其被激活及抑制后續(xù)的細胞周期進展[5]。盡管有研究表明在宮頸癌和頭頸癌中HPV感染與P16表達顯著相關，但在肺癌組織中HPV感染和P16是否存在相關性依然存在爭議[6]。本研究對83例晚期NSCLC患者HPV感染和P16的表達情況做一回顧性分析。

1資料與方法

1.1臨床資料選取83例在2011年8月至2013年8月間到安徽省立醫(yī)院(含南區(qū)、西區(qū))化療的Ⅲ～Ⅳ期的非小細胞肺癌患者，所有病例均經(jīng)臨床和病理確診，且病理標本在我院，其中男53例、女30例，年齡40～84歲(中位數(shù)64歲)，鱗癌21例、腺癌62例。標本類型包括：17例外科手術標本、12例肺活檢標本、15例支氣管鏡活檢標本、24例胸腹水標本、13例淋巴結活檢標本和2例骨活檢標本。所有病例均經(jīng)患者知情同意，并經(jīng)安徽省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。從石蠟包埋的腫瘤組織標本中切取 6～7 片 8 μm厚的切片，放入1.5 mL離心管中備用，同時切取3片6 μm厚的切片固定于載玻片上，以被免疫組化使用。所有石蠟包埋標本切片前均有一位高年資病理科老師現(xiàn)場復鏡，確認所切標本為典型肺癌組織標本，所有石蠟標本切片均為一名高年資病理技術老師親自切片。臨床病理特征包括：年齡、性別、吸煙史、組織類型、組織分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。

1.2組織DNA抽提將放置組織切片的離心管中，加入1 mL的二甲苯，室溫振蕩混勻。離心后棄上清，再加入1 mL的無水乙醇去除二甲苯，離心后按照試劑盒(Qiagen)的操作說明進行樣本DNA的提取，經(jīng)脫蠟、離心、脫苯、渦旋震蕩，孵育過夜等步驟進行樣本DNA的提取，最終將樣品DNA溶解于80 μL洗脫緩沖液中，分光光度計檢測DNA濃度，A260/A280檢測DNA純度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3HPV-DNA分型檢測采用上海透景生命科技公司Luminex液相芯片技術檢測組織中HPV基因型的過程中，PCR擴增所用引物為涵蓋了26種不同HPV亞型的通用型引物，該引物針對組織HPV L1片段的高保守區(qū)[7]。同時，為了對樣本采集量、標本處理、PCR擴增和儀器狀態(tài)進行監(jiān)測，加入了內(nèi)參對照β-globin PCR引物，用于擴增β-珠蛋白基因；應用多重PCR流式雜交技術檢測樣本組織中提取的DNA是否存在HPV的感染，包括19種高危型(HPV-16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，55，56，58，59，66，68，82及83)及7種低危型(HPV-6，11，40，42，44，61及73)。取5 μL提取的DNA樣本進行PCR擴增反應，95 ℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 30 s (5個循環(huán))；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s (35個循環(huán))，72 ℃ 5 min。以此PCR產(chǎn)物進行快速的雜交反應，95 ℃ 5 min；48 ℃ 30 min；Luminex 200多功能流式點陣儀系統(tǒng)進行雜交結果的檢測，然后應用Tellgen公司相應的試劑盒數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4免疫組織化學法檢測P16蛋白表達水平載玻片上的石蠟包埋組織標本經(jīng)一系列濃度的二甲苯，乙醇的混合液侵泡脫蠟，然后用微波爐中蒸煮的方法，采用pH=6.0的10 mmol·L-1的檸檬酸緩沖液進行抗原修復。然后用10倍稀釋的正常兔血清進行抗原封閉，加入鼠抗人P16單克隆抗體，4 ℃冰箱中保存過夜，然后加入生物素標記的鼠抗二抗1 h后，加入DAB顯色。樣本先在低倍鏡下進行評估，然后調(diào)到高倍鏡下根據(jù)細胞染色情況進行P16的分類。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。HPV感染狀態(tài)與臨床病理特征(包括年齡、性別、吸煙史、組織類型、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和P16蛋白表達)的關聯(lián)關系采用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic回歸。 PFS定義為從患者初次診斷時間到復發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間(或至最后失訪的時間)。此外，HPV感染、P16蛋白表達等與患者PFS之間的關系，采用Kaplan-Meier生存分析和COX回歸方法，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1NSCLC患者組織中P16蛋白表達水平根據(jù)組織樣本化學染色陽性顆粒的密度對NSCLC患者組織中P16蛋白表達水平進行定性分析。組織樣本細胞核化學染色分為四個等級：陰性(不能檢測到細胞核染色)、+(可檢測到的細胞核染色)、++(易檢測的可見細胞核染色)、+++(細胞核染色強陽性)。P16蛋白表達的陽性和陰性免疫組織化學染色情況見圖1。

P16陰性圖P16陽性圖

圖1非小細胞肺癌中P16表達水平(免疫組化×400)

2.2NSCLC患者HPV感染與臨床病理特征之間的相關性采用Luminex液態(tài)芯片技術對83例晚期非小細胞肺癌患者進行HPV-DNA檢測，HPV陽性率為24%，其中HPV陽性20例，HPV陰性63例。HPV感染亞型包括HPV16，18，33，58，6 和 11，其中HPV16亞型最為常見。HPV感染主要發(fā)生在非吸煙者、淋巴結轉(zhuǎn)移者和分化程度較差者(P=0.048,P=0.044,P=0.024)。33.7%(28/83)的晚期NSCLC患者腫瘤組織P16表達陽性。然而，未見HPV感染與TP16蛋白表達具有相關性(見表1)。采用多因素Logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)分化程度差(OR=0.163) 是HPV感染的獨立預測因子(見表2)。

表1　NSCLC患者HPV感染與臨床病理

表2　HPV感染影響因素的多因素分析

2.3HPV感染和P16蛋白表達對患者PFS的影響分析為了進一步評估HPV感染、P16蛋白表達對晚期非小細胞患者的相關性，本試驗采用患者PFS作為評價指標。采用Kaplan-Meier生存曲線分析方法繪制HPV感染狀態(tài)(陽性和陰性)、P16蛋白表達(陽性和陰性)生存曲線圖(見圖2)。發(fā)現(xiàn)HPV陽性患者中位無進展生存期為12個月，HPV陰性患者中位無進展生存期為8個月，但差別無統(tǒng)計學意義(HR 0.68,95% CI 0.409～1.161,P=0.162)。P16蛋白表達對晚期NSCLC患者PFS有顯著影響(HR 0.562,95% CI 0.341～0.924,P=0.023)(見表3)，其中P16蛋白表達陽性患者(M=28，其中2個死亡)中位無進展生存期為11個月，TP16陰性患者(M=55，其中3個死亡)中位無進展生存期為8個月。

注：(A)HPV陽性和陰性患者PFS生存曲線圖，HPV陽性患者(n=20，其中1例死亡)中位無進展生存期為12個月，HPV陰性患者(n=63，其中4例死亡)中位無進展生存期為8個月。

(B)P16陽性和陰性患者PFS生存曲線圖，P16陽性患者(n=28，其中2例死亡)中位無進展生存期為11個月，TP16陰性患者(n=55，其中3例死亡)中位無進展生存期為8個月。

圖2Kaplan-Meier生存曲線

3討論

本實驗的研究結果表明，83例我國晚期非小細胞肺癌患者HPV-DNA的檢出率為24%，感染類型以HPV16亞型為主，數(shù)據(jù)同時顯示HPV感染與吸煙、淋巴結轉(zhuǎn)移和組織分化程度顯著相關。同時，我們發(fā)現(xiàn)P16蛋白表達陽性患者較陰性患者有更長的無進展生存期。

表3　Cox回歸分析結果

盡管吸煙已被公認為是引起肺癌的最重要的危險因素，但仍有大約15%的男性肺癌患者和53%的女性肺癌患者一生中從未煙草接觸史[8]，也就是說不吸煙者仍有一部分會患肺癌，HPV感染被認為可能是肺癌發(fā)生的潛在影響因素之一。最近的一項研究表明亞洲人群NSCLC患者HPV感染率為28.1%，歐洲人群NSCLC患者HPV感染率為8.4%，美洲人群NSCLC患者HPV感染率為21.3%，亞洲人群NSCLC患者HPV感染率高于歐美人群[9]。在100多種亞型的HPV病毒中，在NSCLC患者中雖然也檢測出HPV6、11、31、39、52、58、82亞型，但HPV16和18亞型最為常見。本研究中我們檢測出了HPV16、18、33、58、6 和 11，其中HPV16亞型最為常見，與以前報道結果一致。本實驗HPV-DNA陽性檢出率為24%，低于亞洲人群的28.1%，我們推測可能是因為本次試驗選取的樣本均為晚期Ⅲ～Ⅳ NSCLC患者石蠟包埋標本，HPV感染可能與肺癌的臨床分期和標本類型有關。最近研究表明HPV感染的NSCLC患者常見于女性、非吸煙、組織分化程度較差和淋巴結不轉(zhuǎn)移患者。本研究中我們同樣發(fā)現(xiàn)HPV感染與組織分化程度較差、非吸煙者和淋巴結不轉(zhuǎn)移的NSCLC患者，因此，本試驗結果與前期報道結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)晚期NSCLC患者P16蛋白表達與HPV感染無相關性。最近Gatta等[10]采用免疫組化對83例NSCLC組織樣本進行P16蛋白表達分析，也證明TP16蛋白表達與HPV感染無相關性。然而，我們通過生存曲線分析發(fā)現(xiàn)P16蛋白表達陽性患者較陰性患者有更長的無進展生存期，P16可能作為晚期NSCLC患者預后的獨立預測因子。當然研究結果可能受到地域差異影響[11]，下一步我們將進一步研究P16蛋白在NSCLC疾病發(fā)生發(fā)展中可能存在的作用。

總之，本研究我們證實了在晚期NSCLC患者P16蛋白表達與HPV感染無相關性，P16蛋白表達可能作為晚期NSCLC患者預后的預測因子。

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The association between P16 expression and human papillomavirus in advanced non-small cell lung cancer

YAN Yinga,LI Mingb,HU Binga,et al

(a.DepartmentofMedicalOncology；b.DepartmentofClinicalLaboratory，AnhuiProvincialCancerHospital，Hefei,Anhui230031，China)

Abstract:ObjectiveThe present study examined the association between HPV infection and P16 expression in Chinese patients with advanced NSCLC.MethodsA total of 83 advanced NSCLC patients were enrolled in the study.The status and genotype of HPV infection were determined by luminex liquid chip and the presence of P16 expression in tumor tissue was determined by immunohistochemistry.Clinical characteristics of these patients were also recorded to investigate the impact of HPV infection and P16 expression on progression-free survival.ResultsHPV DNA was detected in 20 out of 83 (24%) lung tumors and was observed more frequently in non-smokers,patients with no lymph node metastasis,and patients with poorly differentiated tumors (P=0.048,P=0.044 andP=0.024,respectively).Eight (40%) were positive for P16 expression.Multivariate analysis revealed that poor differentiation alone (odds ratio=0.163) was an independent predictive factor of HPV infection in advanced NSCLC.P16-positive patients had a significantly longer survival time when compared with P16-negative patients(P<0.023,log-rank test).ConclusionsOur results suggest that P16 protein expression is not associated with the expression of HPV DNA,but that P16 expression may be an independent prognostic factor of long survival in advanced NSCLC.

Key words:Carcinoma,non-small-cell lung;Papillomaviridae;Cyclin-dependent kinase inhibitor p16

基金項目:安徽省自然科學基金(1408085MH179)

通信作者:何義富，男，副教授，碩士生導師，研究方向：腫瘤化療相關機制研究，E-mail:18919685630@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.018

(收稿日期：2016-01-27,修回日期：2016-03-23)