張　穎，宋志釗，劉　元

(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥所　廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧　530022)

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高效液相色譜法測定“天竺癇康寧膠囊”中膽紅素的含量

張穎，宋志釗，劉元

(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥所廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧530022)

摘要：目的建立天竺癇康寧膠囊膽紅素含量的高效液相色譜(HPLC)測定方法。方法采用Intersil-C18色譜柱，流動相為甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為450 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 μL。結(jié)果在該條件下，濃度為2.26～45.2 mg·L-1范圍內(nèi)，膽紅素峰面積與其濃度呈良好線性關系(r=0.999 6)，平均回收率為97.4%，RSD為2.02%(n=6)。結(jié)論該方法靈敏、簡便、準確、重復性好，可作為天竺癇康寧膠囊質(zhì)量標準的控制指標之一。

關鍵詞：膽紅素/分析；色譜法,高壓液相；天竺黃；膽南星；中草藥

天竺癇康寧膠囊為南寧翠湖醫(yī)院院內(nèi)制劑，由膽南星、天竺黃、人工牛黃、鉤藤、天麻、遠志、冰片、甘草等二十一味藥材組成，具有清化熱痰，息風定驚，開竅定癇等功效，用于痰火內(nèi)盛所致之癇證發(fā)作。原標準采用人工牛黃、冰片、甘草3個薄層鑒別作為質(zhì)量控制手段，為了提高該制劑質(zhì)量標準，本文參考文獻[1]建立高效液相色譜法(HPLC)測定膽紅素的含量，以提高該藥質(zhì)量標準。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters1525高效液相色譜儀，Waters2998紫外檢測儀；Empowers 2色譜工作站及軟件；梅特勒AL104型電子分析天平；KQ-100VDB雙頻數(shù)控超聲清洗儀。

1.2試劑與試藥膽紅素對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號10077-201206，含量以98.5%計；天竺癇康寧膠囊(廣西忠寧制藥有限公司、批號為：130901、130902、130903)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Intersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為450 nm，進樣量為10 μL；柱溫為室溫；理論塔板數(shù)按膽紅素峰計算應不低于2 000。

2.2線性范圍考察精密稱取膽紅素對照品適量置于棕色量瓶中，用三氯甲烷溶解，制成0.452 g·L-1膽紅素對照品溶液，精密吸取適量，以三氯甲烷稀釋10倍得45.2 mg·L-1的膽紅素對照品儲備液。精密吸取45.2 mg·L-1的膽紅素對照品儲備液，分別稀釋制成2.26、4.52、9.04、18.1、27.1、45.2 mg·L-1的膽紅素對照品工作溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣10 μL，測定，以濃度C(mg·L-1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，計算，得回歸方程為：A=53 814C-63 451，r=0.999 6。結(jié)果表明：膽紅素進樣濃度在2.26～45.2 mg·L-1之間與峰面積積分值呈線性關系。

2.3供試品溶液的制備取本品研細，混勻，取細粉約2 g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，加三氯甲烷25 mL，超聲處理10 min，放冷，加三氯甲烷至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4陰性樣品制備天竺癇康寧膠囊制法中人工牛黃為細粉投料，取缺人工牛黃的處方量，依法制備陰性樣品，

2.5專屬性考察按“2.4”項下陰性樣品。按“2.1”項下色譜條件測定，進樣10 μL，測定，記錄色譜圖，結(jié)果在膽紅素保留時間附近未見有色譜峰出現(xiàn)，表明天竺癇康寧膠囊中其他組份對測定無干擾，色譜圖見圖1。

A.膽紅素對照品

B.天竺癇康寧膠囊樣品(批號：130901)

C.陰性樣品

2.6穩(wěn)定性試驗按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備天竺癇康寧膠囊(批號：130901)供試品溶液1份，分別于0、4、8、12、16 h進行測定，供試品中膽紅素含量的RSD為1.51%，結(jié)果表明供試品溶液在16 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7精密度試驗吸取同一對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進樣6次，測得對照品溶液峰面積RSD為1.49%。

2.8重復性試驗按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備天竺癇康寧膠囊(批號：130901)6份，分別進樣測定，測得膽紅素含量RSD=1.67%(n=6)。結(jié)果測得平均值0.094 4 mg·g-1，表明該方法重復性良好。

2.9加樣回收試驗精密稱取天竺癇康寧膠囊(批號：130901)1 g，加入濃度9.04 mg·L-1膽紅素對照品溶液10 mL，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備。結(jié)果膽紅素平均回收率為97.4%，RSD=2.02%(n=6)，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗測量結(jié)果(n=6)

2.10樣品測定按供試液的制備及檢測方法，測定3批天竺癇康寧膠囊(批號130901、130902、130903)中膽紅素含量分別為0.095 3、0.091 4、0.093 8 mg·g-1。

3討論

人工牛黃苦，涼，歸肝，心經(jīng)，清熱解毒，息風止痙，化痰開竅，為天竺癇康寧膠囊臣藥之一。天竺癇康寧膠囊藥味眾多，每味藥處方量較小，因此有必要建立靈敏、簡便、準確、重復性好的方法來控制制劑質(zhì)量。膽紅素的含量測定方法收載于歷年中國藥典，《中國藥典》2015年版中使用紫外-可見分光光度法測定含量[2]。但紫外法測定易受其他藥味影響[3]，在藥物制劑質(zhì)量標準研究工作中，許多含有人工牛黃的制劑使用HPLC法測定膽紅素的含量作為控制制劑質(zhì)量的手段之一[4-9]。在光照條件下，膽紅素極易氧化[10]，但張東方等[11]研究表明，HPLC測定制劑中膽紅素的含量，在避光的條件下，精密度、重復性及回收率可滿足實驗要求。筆者對文獻[4-9,11]采用的流動相進行了摸索試驗，結(jié)果甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)的分離效果，且峰型好，滿足分析方法要求，同時做了方法學摸索，結(jié)果提取方法超聲(0.089 5 mg·g-1)>回流(0.074 3 mg·g-1)，提取溶劑三氯甲烷(0.094 1 mg·g-1)>流動相(0.013 8 mg·g-1)>甲醇(0.008 3 mg·g-1)，超聲10、20 min結(jié)果相差不大，超聲30 min膽紅素含量稍低，提取劑量15 mL(0.098 2 mg·g-1)>25 mL(0.096 4 mg·g-1)>50 mL(0.073 7 mg·g-1)?？紤]到供試品取樣體積比較大，最終選擇提取劑量25 mL。根據(jù)方法學考察結(jié)果，天竺癇康寧膠囊膽紅素的提取以三氯甲烷25 mL作為提取劑，超聲處理10 min。在“2.1色譜條件”下，考察了Intersil C18、Wondasil C18、Apollo C183根不同品牌填料的色譜柱對樣品中膽紅素峰含量影響，結(jié)果表明，理論塔板數(shù)均在2 000以上，表明該測定該方法測定膽紅素，對色譜柱選擇性不強，適用范圍廣。

參考文獻

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Determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules by HPLC

ZHANG Ying,SONG Zhi-zhao,LIU Yuan

(TheDivisionofTraditionalChineseMedicine,GuangxiInstituteofChineseMedicine&PharmaceuticalScienceGuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineQualityStandards,Nanning，Guangxi530022，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules.MethodsThe Intersil-C18column was used,and the mobile phase consisted of Methanol-trichloromethan-1% phosphoric acid (80∶14∶6) with the flow rate at 1.0 mL·min-1.The detection wave length was 450 nm and the sample size was 10 μL.ResultsLinearity of bilirubin was good around 2.26～45.2 mg·L-1，r=0.999 6.The average recovery was 97.4% with RSD less than 2.02% (n=6).ConclusionsThe method is sensitive,simple,accurate and repeatable,which can be applied to the determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules.

Key words:Bilirubin/analysis;Chromatography,high pressure liquid;Concretio silicea bambusae;Arisaema cum bile;Drugs,chinese herbal

基金項目:廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(GZZJ14-11);南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃(20143135)

通信作者：劉元，女，主任藥師，研究方向：中藥藥理與新藥研制開發(fā)，E-mail:Liuyuan0821@vip.163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.017

(收稿日期：2015-12-01，修回日期：2016-04-27)