沈秀珍,王　凌,方毅華

(赤壁市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 赤壁　437300)

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銀杏總黃酮通過調(diào)節(jié)自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的研究

沈秀珍,王凌,方毅華

(赤壁市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 赤壁437300)

摘要：目的探討銀杏總黃酮是否可以通過調(diào)節(jié)自噬減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷以及可能的機(jī)制。方法采用大鼠心肌I/R模型(缺血30 min，再灌注4 h)，雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(SO組，n=10)、缺血再灌注組(I/R組，n=10)和銀杏總黃酮治療組(YLTF+I/R組，n=10，100 mg·kg-1，造模前灌胃7 d)。檢測心肌損傷標(biāo)記物肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白I(cTnI)；檢測氧化應(yīng)激水平，即丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；檢測自噬蛋白beclin-1和LC3水平。結(jié)果與SO組比較，I/R可誘導(dǎo)心肌損傷標(biāo)記物(CK、LDH和cTnI)表達(dá)升高，氧化應(yīng)激水平的增加(MDA表達(dá)增加，SOD表達(dá)降低)和自噬的過度激活(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，beclin-1表達(dá)增加)；與I/R比較，銀杏總黃酮可顯著的降低心肌損傷標(biāo)記物(CK、LDH和cTnI)的表達(dá)、氧化應(yīng)激水平(MDA表達(dá)降低，SOD表達(dá)增加)和自噬的過度激活(LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，beclin-1表達(dá)減低)。結(jié)論銀杏總黃酮可以通過抑制過度自噬減輕心肌I/R損傷，這可能與其抑制氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：再灌注損傷；銀杏素；自噬；大鼠,Sprague-dawley

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激或不良狀態(tài)下的一種自我保護(hù)過程，可以清除降解的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器[1]。通常認(rèn)為，自噬是細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維護(hù)者，然而，過度的自噬也可以引起細(xì)胞死亡，稱為自噬性程序性細(xì)胞死亡(程序性死亡共三種，另外兩種為凋亡和壞死)，這說明自噬對細(xì)胞的影響是多樣的、復(fù)雜的[2]。前期的研究證實(shí)，自噬是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，它在損傷的起始和進(jìn)展過程中都發(fā)揮了重要作用[3-4]。

銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract,EGb)具有良好的藥用價值，且已有多種產(chǎn)品用于臨床，如銀杏葉片，銀杏達(dá)莫等。研究發(fā)現(xiàn)，EGb具有抗炎、抗氧化、擴(kuò)血管、改善循環(huán)和降血脂等多種作用[5-6]。銀杏總黃酮是銀杏葉提取物中含量最高的活性成分，具有良好的抗氧化和清除自由基的作用[7-8]。我們知道，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致自噬過度激活的重要因素[9-10]，但銀杏總黃酮是否可以通過調(diào)節(jié)自噬減輕心肌I/R損傷，目前尚無研究，為驗(yàn)證上述假設(shè)我們在2015年10～12月進(jìn)行了下述研究。

1資料與方法

1.1動物準(zhǔn)備與分組30只SPF級成年雄性SD大鼠(200～250 g，動物合格證號：43004700019087)，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。于恒溫、恒濕、明/暗交替(12 h)的環(huán)境喂養(yǎng)48 h。

大鼠缺血再灌注模型：2%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg·kg-1，ip)后，仰臥固定于鼠板，氣管插管(頻率：70 bpm，吸呼比=1∶1.5，潮氣量：3～4 mL/100 g，小動物呼吸機(jī)：江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司)。胸骨左緣切口，暴露心臟，破心包膜；于左心耳下2～3 mm處將前降支與一個中間帶有凹槽的空心乳膠管一起結(jié)扎。結(jié)扎線下心肌變蒼白表明缺血成功。缺血30 min后，沿乳膠管凹槽剪斷結(jié)扎線再灌注4 h。再灌注4 h后，2%戊巴比妥鈉麻醉(20 mg·kg-1,ip)，頸靜脈采血2 mL，迅速剪下心臟，剪除多余部分留取心梗區(qū)(白色)和缺血區(qū)(白色附近5 mm)用于檢測。30只大鼠隨機(jī)分為3組：(1)手術(shù)組(SO，n=10)：僅插管、開胸、LAD下穿線但不結(jié)扎；(2)缺血再灌注組(I/R，n=10)：按照上面所述造模，缺血30 min，再灌注4 h；(3)青蒿素治療組(YLTF+I/R，n=10)：造模前銀杏葉總黃酮灌胃7 d(100 mg·kg-1，西安源森生物科技有限公司)，造模同I/R組。

1.2檢測指標(biāo)和方法

1.2.1分光光度法檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)，肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白I(cTnI)通過心肌損傷標(biāo)記物(LDH、CK、cTnI)的表達(dá)水平反映心肌損傷情況。靜脈采血后靜置10 min，待血液凝固后離心(3 000 r·min-1×15 min)，取血清。選用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴(yán)格按照說明操作檢測LDH和CK。

1.2.2檢測丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平通過檢測MDA和SOD評價心肌組織氧自由基含量和脂質(zhì)超氧化水平。檢測方法如前所述[11]，采用南京建成生物工程研究所的MDA和SOD試劑盒，嚴(yán)格按照說明操作。

1.2.3Western blot法檢測LC3和beclin-1方法如前所述[12]，簡言之，組織勻漿在PAGE膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，1抗孵育過夜，包括LC3(1∶500稀釋，sigma)，beclin-1(1∶500稀釋，Abcanm)和β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)。在相應(yīng)的二抗孵育后，ECL顯色，以其與β-actin的比值表示其相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1血清LDH，CK和cTnI結(jié)果見表1。與SO組比較，I/R組中LDH，CK和cTnI水平明顯升高(P<0.05)；YLTF+I/R組中CK和cTnI水平明顯增高(P<0.05)，LDH有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與I/R組比較，YLTF+I/R組中LDH、CK和cTnI水平明顯降低(P<0.05)。

表1　青蒿素對心肌損傷標(biāo)記物的影響

注：與SO組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05。

2.2心肌組織MDA和SOD水平結(jié)果見表2。與SO組比較，I/R組中MDA表達(dá)明顯升高，而SOD表達(dá)明顯降低。與I/R組比較，YLTF+I/R組中MDA表達(dá)明顯下降，而SOD表達(dá)明顯升高(均P<0.05)。

2.3心肌組織LC3與beclin-1水平結(jié)果見表2。與SO組比較，I/R組中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明顯升高(均P<0.05)。與I/R組比較，YLTF+I/R組中LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1水平明顯降低(均P<0.05)。

3討論

銀杏葉是我國臨床上經(jīng)常使用的中藥材之一，EGb種類繁多，其中最重要的活性成分為總黃酮和萜內(nèi)酯(包括白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯)。在EGb中總黃酮含量達(dá)到24%，萜內(nèi)酯僅占0.6%，可見總黃酮為EGb的主要活性成分。研究證實(shí)，銀杏葉總黃酮有顯著的擴(kuò)血管、抗氧化的作用[7-8]。進(jìn)一步證實(shí)，EGb的抗氧化作用與抑制NF-kapaB通路激活相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉總黃酮可明顯抑制氧自由基生成(降低MDA水平)，增加脂質(zhì)超氧化(增加SOD水平)，這進(jìn)一步印證了銀杏總黃酮具有明顯抗氧化作用[13]。但本研究首次發(fā)現(xiàn)，銀杏總黃酮可以明顯降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和beclin-1表達(dá)，及抑制過度自噬減輕心肌缺血再灌注損傷。

表2　青蒿素對氧化應(yīng)激和自噬的影響

注：與SO組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05。

研究表明，自噬是心肌I/R的重要病理生理機(jī)制之一[3-4]。I/R誘導(dǎo)的ATP耗竭、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)降解等均會增強(qiáng)自噬[9-10]。自噬對細(xì)胞的影響是多面性的，適度的自噬可以幫助細(xì)胞清除降解的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器，具有保護(hù)作用，但過度激活自噬卻可以導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。目前自噬對心肌I/R的作用尚無定論，通常認(rèn)為，在心肌缺血階段，自噬被適度激活，表現(xiàn)為心肌保護(hù)作用，但在再灌注階段，自噬被過度激活，表現(xiàn)為加重心肌損傷的作用[3-4]。Matsui等[10]證實(shí)，在心肌再灌注階段beclin-1水平明顯升高bcl-2明顯降低，標(biāo)志自噬被過度激活，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡。beclin-1是一種關(guān)鍵的自噬蛋白，可以調(diào)節(jié)自噬小體的形成和進(jìn)展。在再灌注階段，beclin-1是誘導(dǎo)自噬過度激活的關(guān)鍵蛋白，研究證實(shí)，通過siRNA抑制beclin-1表達(dá)可以抑制自噬的過度激活，減輕I/R損傷[14-15]。眾所周知，在再灌注階段，氧自由基的過度生成而非能量耗竭是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的主要因素。Hariharan等[16]證實(shí)，氧自由基的生成伴隨beclin-1的高表達(dá)，給予抗氧化劑處理可明顯降低beclin-1的表達(dá)，這說明，活性氧是通過調(diào)節(jié)beclin-1的表達(dá)調(diào)節(jié)再灌注階段的心肌細(xì)胞自噬。另外，LC3為自噬相關(guān)蛋白，LC3-Ⅱ?yàn)橹|(zhì)化的活性狀態(tài)，LC3-Ⅰ為未脂質(zhì)化的非激活狀態(tài)，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值可以反應(yīng)自噬的激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧可通過抑制ATG4的激活，促進(jìn)LC3脂質(zhì)化激活自噬[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏總黃酮可以明顯抑制氧化應(yīng)激(降低MDA水平，升高SOD水平)，抑制過度自噬(降低beclin-1水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值)，因此我們推測，銀杏總黃酮可以通過抑制氧化應(yīng)激，抑制心肌I/R中自噬過度激活。

綜上所述，銀杏總黃酮可以通過抑制氧化應(yīng)激抑制I/R過程中過度自噬進(jìn)而減輕心肌I/R損傷。

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Yinxing leaf total flavonoid mitigates myocardial ischemia and reperfusi on injury via regulating autophagy

SHEN Xiu-zhen,WANG Ling,FANG Yi-hua

(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofChibi,Chibi,Hubei437300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate whether Yinxing leaf total flavonoid could mitigate myocardial ischemia and reperfusion(I/R) injury and the possible mechanism.MethodsRats I/R model (ischemia 30 min,then reperfusion 4 h) was used.30 rats were divided into three groups:sham-operation group (SO,n=10),ischemia and reperfusion group (I/R,n=10) and Yinxing leaf total flavonoid treatment group (YLTF+I/R,n=10,100 mg·kg-1).Cardiac injury markers (serum creatine(CK),lactate dehydrogenase(LDH),and cTnI),oxidative stress (malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD)) and autophagy markers (beclin-1 and LC3) were detected.ResultsCompared with SO group,levels of cardiac injury markers (CK,LDH and cTnI) and oxidative stress (MDA and SOD) significantly increased; autophagy was excessively activated in I/R group.Compared with I/R group,Yinxing leaf total flavonoid significantly decreased cardiac injury markers'(CK,LDH and cTnI) expression and oxidative stress (MDA expression increased and SOD expression decreased),and suppressed excessive activation of autophagy both beclin-1 level and LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio decreased).ConclusionsYinxing leaf total flavonoid could mitigate I/R injury via inhibiting excessive activation of autophagy.It's possible that Yinxing leaf total flavonoid inhibited excessive autophagy via suppressing oxidative stress.

Key words:Reperfusion Injury;Ginkgetin;Autophagy;Rats,Sprague-dawley

作者簡介：沈秀珍，女，副主任醫(yī)師，研究方向:心肌梗死和冠心病方向研究，E-mail：414542231@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.010

(收稿日期：2016-02-23，修回日期：2016-03-20)