馮源恒　楊章旗　　　　李火根　　　　黃永利

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧，530002)　　　(南京林業(yè)大學(xué))　　　(南寧市林業(yè)科學(xué)研究所)

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廣西馬尾松第一代育種群體遺傳多樣性1)

馮源恒楊章旗李火根黃永利

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧，530002)(南京林業(yè)大學(xué))(南寧市林業(yè)科學(xué)研究所)

摘要利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了廣西馬尾松第一代育種群體464個(gè)無(wú)性系的指紋圖譜，并分析了該育種群體的遺傳多樣性。研究結(jié)果表明，廣西馬尾松第一代群體的平均等位基因數(shù)為3.19，多態(tài)率為100%；平均有效等位基因數(shù)為1.79；Shannon多樣性指數(shù)平均為0.65，平均觀測(cè)雜合度為0.40，表明該育種群體具有較高的遺傳多樣性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于人工林優(yōu)樹無(wú)性系的平均等位基因數(shù)高于來(lái)源于天然林優(yōu)樹無(wú)性系，而天然林優(yōu)樹無(wú)性系的近交系數(shù)低于人工林優(yōu)樹無(wú)性系。

關(guān)鍵詞馬尾松；育種群體；遺傳多樣性；SSR；指紋圖譜

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國(guó)分布最廣的針葉樹種，也是我國(guó)南方地區(qū)重要的用材、荒山造林和工業(yè)原料樹種，其木材和松脂是許多森林工業(yè)、林產(chǎn)工業(yè)和造紙工業(yè)的支柱，而其花粉則營(yíng)養(yǎng)豐富，是新一代的食療珍品。馬尾松在我國(guó)亞熱帶地區(qū)約占國(guó)土1/5范圍內(nèi)的山地均有其分布；林分總面積居全國(guó)針葉樹種首位；蓄積量?jī)H次于云杉、冷杉和落葉松，居全國(guó)針葉樹種第4位[1]。廣西是馬尾松主要分布區(qū)，也是馬尾松最重要的優(yōu)良種源區(qū)，馬尾松遺傳育種資源極其豐富。目前,廣西馬尾松的育種研究正步入高世代改良階段。為了實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的多世代改良，在對(duì)馬尾松的育種群體進(jìn)行管理與研究時(shí)不但要關(guān)注其生長(zhǎng)性狀在改良過(guò)程中所能獲得的增益，還需要對(duì)群體的遺傳多樣性狀況、個(gè)體間近交程度等遺傳信息進(jìn)行深入了解。本研究以SSR分子標(biāo)記為技術(shù)手段為廣西馬尾松第一代育種群體建立遺傳位點(diǎn)信息庫(kù)，并將之應(yīng)用于育種群體遺傳多樣性、指紋圖譜建立問(wèn)題等研究，為馬尾松高世代育種研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

廣西馬尾松第一代育種群體構(gòu)建于20世紀(jì)80年代，以生長(zhǎng)量為主要改良性狀。材料源自1976年、1977年及1984年對(duì)廣西全境的馬尾松人工林和優(yōu)良種源的天然優(yōu)良林分進(jìn)行優(yōu)樹選擇所得的優(yōu)良單株[2-3]。目前所有材料均以無(wú)性系的形式保存在南寧市林科所廣西松類種質(zhì)資源庫(kù)，共有464個(gè)無(wú)性系。其中有153個(gè)選自廣西桐棉、古蓬、容縣3大優(yōu)良種源區(qū)的馬尾松天然林，有311個(gè)選自廣西境內(nèi)30個(gè)國(guó)有林場(chǎng)的人工林。目前，所有育種群體材料均以無(wú)性系形式(每個(gè)無(wú)性系8個(gè)分株)保存在南寧市林科所馬尾松國(guó)家級(jí)良種基地2010年新建的馬尾松基因庫(kù)中。2012年6月采集每個(gè)無(wú)性系的新鮮針葉并冷凍保存。

1.1DNA的提取

松樹針葉DNA提取采用CTAB裂解—硅珠吸附法[4]。純化后DNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)純度后置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物來(lái)源及SSR-PCR反應(yīng)條件

本研究所使用的SSR引物根據(jù)廣西林科院對(duì)馬尾松基因組DNA測(cè)序所得基因組DNA序列設(shè)計(jì)開發(fā)，共計(jì)506對(duì)[5]。篩選16對(duì)多態(tài)性高的SSR引物用于遺傳位點(diǎn)信息平臺(tái)庫(kù)。所設(shè)計(jì)引物由上海捷瑞基因技術(shù)有限公司合成，Taq酶、dNTPs購(gòu)自捷瑞生物工程公司。PCR反應(yīng)體系為10 μL：Tris-HCl 10 mmol/L pH 8.0，KCl 50 mmol/L，Mg2+2.5 mmol/L，dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2 mmol/L)，引物2.5×10-12mol，Taq聚合酶0.08 U，DNA 10～20 ng。擴(kuò)增反應(yīng)程序采用Touch-down PCR：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s(Δ℃=-0.5)，72 ℃ 30 s，16次循環(huán)；在進(jìn)入94 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，10次循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。

1.3PCR產(chǎn)物的銀染檢測(cè)

SSR-PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測(cè)。銀染檢測(cè)步驟為：PCR產(chǎn)物加等體積上樣緩沖液，8%聚丙烯酰胺凝膠(100 mL凝膠包括42 g尿素，20 mL 40%丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺,0.5 mL 10%過(guò)硫酸銨，50 μL TEMED，10 mL 10×TBE電泳緩沖液)240 V穩(wěn)壓電泳1 h后固定染色；固定10 min(固定液10%乙醇，0.5%乙酸)，ddH2O漂洗2次，每次2 min；再用0.15% AgNO3染色7 min，ddH2O漂洗2次，每次2 min，最后顯影(1.5% NaOH,0.007 56% NaBO4,1%甲醛)至條帶清晰，照相記錄。

1.4遺傳多樣性分析

SSR是共顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性。采用凝膠成像系統(tǒng)，對(duì)所得的圖片進(jìn)行判讀，然后根據(jù)所讀的數(shù)據(jù)用A，B，C，D，E…按條帶長(zhǎng)度大小從大到小進(jìn)行編號(hào)。采用POPGENE32軟件[6]計(jì)算下列遺傳參數(shù)：(1)多態(tài)位點(diǎn)百分率(Percentage of polymorphic loci，PPB)；(2)觀測(cè)等位基因數(shù)目(Observed number of alleles)；(3)有效等位基因數(shù)目(Effective number of alleles)[7]；(4)Shannon’s多樣性指數(shù)(Shannon’s information index)[8]；(5)觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity)。采用Coancestry Version 1.0軟件[9]計(jì)算群體內(nèi)的共祖系數(shù)[10-13]。

2結(jié)果與分析

2.1第一代育種群體指紋圖譜建立

采用16對(duì)SSR引物對(duì)464個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立起一個(gè)464×16規(guī)模的遺傳位點(diǎn)信息庫(kù)。根據(jù)所獲得的遺傳位點(diǎn)信息，對(duì)464個(gè)無(wú)性系構(gòu)建了指紋圖譜。圖譜中每一列數(shù)據(jù)(前兩列除外)是某一SSR標(biāo)記在各份材料中檢測(cè)出的帶型的數(shù)字化代號(hào)，一個(gè)代號(hào)代表一對(duì)等位基因型。每一行中的數(shù)字按從左到右的順序構(gòu)成一條字符串(前兩列除外)，字符串的位數(shù)為32位(每個(gè)SSR位點(diǎn)兩位)。如無(wú)性系桂GC900A的指紋數(shù)字條碼是02020508080802050206060504010503。在本研究中16對(duì)標(biāo)記可以全部區(qū)分464個(gè)無(wú)性系，鑒別成功率為100%。

圖1　引物PF463擴(kuò)增SSR產(chǎn)物電泳圖

2.2廣西馬尾松第一代育種群體遺傳多樣性

采用16對(duì)SSR引物在464個(gè)樣本中共檢測(cè)到16個(gè)位點(diǎn)51個(gè)等位基因，多態(tài)率為100%。每個(gè)位點(diǎn)平均觀察等位基因數(shù)為3.19，平均有效等位基因數(shù)1.79。表1列出了馬尾松第一代育種群體不同位點(diǎn)的遺傳多樣度參數(shù)。不同位點(diǎn)的多樣性參數(shù)差別很大，PF402位點(diǎn)的Shannon多樣性指數(shù)最高為1.08，PF569、PF615位點(diǎn)的多樣性指數(shù)值最低為0.30，平均為0.65。平均觀測(cè)雜合度為0.40。

采用Coancestry Version 1.0軟件計(jì)算得到第一代育種群體465個(gè)無(wú)性系在16個(gè)位點(diǎn)的平均共祖系數(shù)為0.079，育種群體狀態(tài)數(shù)為6.33。

2.3不同來(lái)源的育種材料的遺傳多樣性

在馬尾松第一代育種群體的464個(gè)無(wú)性系中，有153個(gè)選自廣西桐棉、古蓬、容縣3個(gè)優(yōu)良種源區(qū)的馬尾松天然林，有311個(gè)選自廣西境內(nèi)30個(gè)國(guó)有林場(chǎng)的人工林。為了研究天然林選優(yōu)材料與人工林選優(yōu)材料的遺傳多樣性差異，本研究對(duì)二者進(jìn)行了單獨(dú)分析。

表1　馬尾松第一代育種群體在16個(gè)遺傳位點(diǎn)的遺傳多樣度

天然林選優(yōu)材料在16個(gè)位點(diǎn)上共擴(kuò)增到45個(gè)等位基因。每個(gè)位點(diǎn)平均觀察等位基因數(shù)為2.85，平均有效等位基因數(shù)1.73，Shannon多樣性指數(shù)平均為0.61，平均觀測(cè)雜合度為0.40，近交系數(shù)為0.063。

人工林選優(yōu)材料在16個(gè)位點(diǎn)上共擴(kuò)增到50個(gè)等位基因。每個(gè)位點(diǎn)平均觀察等位基因數(shù)為3.1，平均有效等位基因數(shù)1.68。Shannon多樣性指數(shù)平均為0.59。平均觀測(cè)雜合度為0.37，近交系數(shù)為0.087(表2)。

表2　不同來(lái)源育種材料的遺傳多樣性差異

3結(jié)論與討論

廣西馬尾松第一代育種群體選自3個(gè)種源區(qū)的天然林和30個(gè)林場(chǎng)的人工林，是國(guó)內(nèi)規(guī)模較大的馬尾松育種群體之一。以其為材料建立的初級(jí)種子園對(duì)照本區(qū)馬尾松材積增益為127.43%，對(duì)照外省(粵、黔)馬尾松材積增益為203.02%，對(duì)照本區(qū)濕地松材積增益為124.63%，表現(xiàn)出很明顯改良效果。經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)該群體的平均等位基因數(shù)為3.19，多態(tài)率為100%；平均有效等位基因數(shù)為1.79；Shannon多樣性指數(shù)(I)平均為0.65，平均觀測(cè)雜合度為0.40。高于湖北京山馬尾松無(wú)性系種子園(I=0.48)[14]、廣東韶關(guān)馬尾松無(wú)性系種子園(I=0.36)[15]及浙江淳安馬尾松第一代育種群體(I=0.55)[16]。這說(shuō)明廣西馬尾松第一代育種群體不論是在改良增益上還是在遺傳基礎(chǔ)的寬度上都處于較高水平。

馬尾松具有悠久的人工栽培史，在分布區(qū)內(nèi)有大量的人工林。由于歷史原因許多人工林的種源、產(chǎn)地等遺傳背景信息已經(jīng)丟失。在進(jìn)行育種材料選擇時(shí)往往一方面不忍放棄人工林中大量的優(yōu)良個(gè)體，一方面又擔(dān)心在遺傳背景不明的情況下從中選擇育種材料會(huì)影響育種群體的遺傳多樣性水平。從本研究結(jié)果可知人工林選優(yōu)材料的平均等位基因數(shù)要高于天然林選優(yōu)材料，這說(shuō)明幾乎覆蓋廣西全境的國(guó)有林場(chǎng)的馬尾松人工林所具有的基因型要比3個(gè)優(yōu)良種源區(qū)更為豐富。但天然林選優(yōu)材料的近交系數(shù)低于人工林。這可能是由于人工林在造林種子采集時(shí)往往選擇數(shù)量較少的幾個(gè)優(yōu)良林分或優(yōu)良單株造成了林分的近交情況上升。同時(shí)人工林的平均有效等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)及觀測(cè)雜合度都低于天然林，這也與人工林種子來(lái)源范圍有限有關(guān)。

育種群體作為進(jìn)行遺傳改良研究的核心材料，利用各類分子標(biāo)記對(duì)之進(jìn)行遺傳多樣性研究的報(bào)道已有很多[16-18]。但由于育種群體規(guī)模較大，相關(guān)研究往往采用抽樣方法進(jìn)行取樣。這樣得到的數(shù)據(jù)雖可以在一定程度上反映出群體在該研究方向上的遺傳信息，但由于不是全部取樣，所得到的數(shù)據(jù)難以被關(guān)于該育種群體其它方面的遺傳研究再次利用。因此針對(duì)育種群體全部材料建立一定規(guī)模的遺傳位點(diǎn)信息平臺(tái)，相當(dāng)于為所有個(gè)體建立一份遺傳信息檔案，所得到的遺傳信息可以為與之相關(guān)各類研究共用，既避免了重復(fù)取樣造成的科研資源浪費(fèi)又方便對(duì)今后更高世代育種材料進(jìn)行遺傳譜系管理。這項(xiàng)具有重要應(yīng)用價(jià)值的基礎(chǔ)科研工作應(yīng)成為林木改良研究系統(tǒng)中必要的環(huán)節(jié)。

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Genetic Diversity ofPinusmassonianain the First Generation Breeding Population in Guangxi

Feng Yuanheng, Yang Zhangqi

(Guangxi Institute of Forestry Science, Nanning 530002, P. R. China); Li Huogen(Nanjing Forestry University); Huang Yongli(Nanning Forestry Division)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：1-3.

We used the genomic SSR markers ofPinusmassonianato construct fingerprints with the size of 464 clones for the first generation of breeding population ofP.massonianain Guangxi, and analyzed the genetic diversity of the breeding population. The mean number of alleles (Na) per locus was 3.19, the polymorphism rate was 100%, the mean number of effective alleles (Ne) per locus was 1.79, the Shannon’s information index (I) was 0.65 and the average observed heterozygosity (Ho) was 0.40, indicating that the breeding population maintains high levels of genetic variation. In the first generation of the breeding population, the clones from plantations were higher than those from natural forests in the average number of alleles and inbreeding coefficient.

KeywordsPinusmassoniana; Breeding population; Genetic diversity; SSR; fingerprints

第一作者簡(jiǎn)介：馮源恒，男，1981年6月生，廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，工程師。E-mail:nanyuan05@163.com。 通信作者：楊章旗，廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，教授級(jí)高級(jí)工程師。E-mail:yangzhangqi@163.com。

收稿日期：2015年11月12日。

分類號(hào)S759.3

1)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560216)；廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFBA118078)；廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題(12B0102)。

責(zé)任編輯：潘華。