范青松，邢　坤，劉海映，孫靜嫻，陳　雷，劉　奇

（1.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；2.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧大連116023）

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口蝦蛄腦部褐脂質分布、組織學和超微結構特征研究

范青松1，邢坤1，劉海映1，孫靜嫻2，陳雷1，劉奇1

（1.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；2.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧大連116023）

摘要：為了解口蝦蛄Oratosquilla oratoria腦部形態(tài)特征，揭示口蝦蛄生理年齡與褐脂質 （lipofuscin）含量的關系，采用組織切片、熒光成像和透射電鏡技術，研究了口蝦蛄腦中褐脂質的形態(tài)、分布和超微結構特征。結果表明：口蝦蛄腦位于眼節(jié)之后、頭腦甲最前方，體積較小；H.E組織切片下腦部細胞核顆粒呈圓形且均勻分布，直徑為10～30μm，并在腦前橋細胞團 （protocerebral bridge cellmass）區(qū)域分布較多；熒光顯微鏡下褐脂質顆粒呈黃褐色，直徑為1～3μm，均勻分布于腦部；透射電鏡下可見褐脂質顆粒多聚集分布于近細胞核區(qū)域，外被單層細胞器膜，染色密度較其他區(qū)域高且均勻。研究表明，整體上口蝦蛄腦部褐脂質分布均勻，其形態(tài)與其他甲殼動物腦部褐脂質相似。

關鍵詞：口蝦蛄；腦；褐脂質；超微結構

口蝦蛄Oratosquillaoratoria隸屬于節(jié)肢動物門Arthropoda、甲殼綱Crustacea、口足目Stomatopoda、蝦蛄科Squillidae、口蝦蛄屬Oratosquilla［1］，是常見的海產經濟動物，為底棲穴居蝦類。口蝦蛄是中國沿海重要的甲殼類動物之一，從黃、渤海向南至南海，在香港周邊海域和北部灣均有發(fā)現?？谖r蛄是中國近海重要的漁業(yè)資源，國內對口蝦蛄繁殖的生物學特征進行了大量研究［2-4］。近年來，隨著捕撈強度的加大，研究人員對口蝦蛄的分布和漁業(yè)資源特征進行了調查分析［5-6］，結果表明，口蝦蛄常為沿海底棲生物群落中的優(yōu)勢種，是重要的經濟物種。目前，對十足類甲殼動物腦部組織結構的研究較多［7-8］。Stegner等［9］對馬蹄蝦 Hutchinsoniella macracantha腦部形態(tài)進行了分析研究，明確了腦部系統神經三維立體結構；Fanenbruck等［10］研究發(fā)現，甲殼動物槳足綱Remipedia腦部不同組織結構與其系統生長發(fā)育有關；Kodama等［11-12］研究表明，口蝦蛄腦部及其褐脂質分布與組成規(guī)律可用于種群年齡組成鑒定，但對口蝦蛄腦部褐脂質超微結構的研究尚未見報道。本研究中分析了口蝦蛄腦部組織中褐脂質的形態(tài)、分布和超微結構特征，以期利用褐脂質作為年齡參照物準確鑒定口蝦蛄年齡結構 （age structure），開展口蝦蛄種群生態(tài)學研究，闡明口蝦蛄資源生物學特征，為開發(fā)與利用口蝦蛄資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品為2014年6月采自遼寧省渤海海域的野生群體口蝦蛄，共20只，不分雌雄，體長為（12.69±0.7）cm，體質量為 （19.93±3.54）g。

1.2 方法

1.2.1 光學顯微鏡觀察 取口蝦蛄腦部組織采用Bonin氏液固定，用梯度酒精 （50％、70％、80％、90％、95％、100％）脫水后包埋，采取水平及縱向切片，厚度為6μm，用蘇木精、伊紅染色，并使用Nikon 50i型光學顯微鏡觀察。1.2.2 熒光顯微鏡觀察 取口蝦蛄腦部活體組織，直接在梯度酒精（70％、80％、90％、95％、100％）下脫水后包埋，采取水平及縱向切片，厚度為6μm，在Olympus BX51熒光顯微鏡下直接觀察，激發(fā)光波長為580 nm，觀察時波長為488 nm。1.2.3 透射電鏡觀察 在解剖鏡下從口蝦蛄頭腦部背部完整取出口蝦蛄腦，置于2.5％戊二醛 （用pH為7.2的磷酸緩沖液配制）中固定，并于冰箱（4℃）中保存過夜，然后用1％鋨酸 （用pH為7.2的磷酸緩沖液配制）后固定2 h。經過梯度酒精 （50％、70％、80％、90％、95％、100％）脫水和純丙酮轉換后，用環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，再用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，切片厚度為70 nm，采用JEM-1200EX型透射電鏡 （日本電子公司）觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 組織結構

在對口蝦蛄活體解剖時，可見其腦位于眼節(jié)后端之頭腦甲最前緣 （圖1-A），呈橢圓形，有長徑、短徑；肉眼可見褐脂質色素累積，顏色與周圍的甲殼、肌肉組織差別明顯，容易區(qū)分 （圖1-B）。組織切片下 （圖1-C、D），腦部神經細胞核顆粒為深色顆粒，呈圓形，直徑為10～30μm，褐脂質顆粒不明顯；腦組織周圍分布有結締組織和肌肉組織，起到支撐和保護腦細胞的作用；口蝦蛄腦前橋細胞團 （PBCM）是神經細胞密集分布區(qū)域。熒光顯微鏡下，明顯可見黃色的褐脂質顆粒廣泛分布于口蝦蛄腦中 （圖1-E、F），周圍結締組織和肌內組織中未觀察到褐脂質顆粒。

注：A為口蝦蛄腦部位置；B為甲殼下口蝦蛄腦部形態(tài)；C、D為褐脂質顆粒分布；E、F為熒光顯微鏡下褐脂質分布。BR示腦；M示肌肉；N示細胞核顆粒；L示褐脂質顆粒；PBCM示腦前橋細胞團Note：A，the position of brain in mantis shrimp Oratosquilla oratoria；B，the vivisection of brain；C，D，the distribution of lipofuscin in the brain；E，F，the distribution of lipofuscin under a fluorescencemicroscope.BR，brain；M，muscle；N，nuclear particle；L，lipofuscin；PBCM，protocerebral bridge cellmass圖1　口蝦蛄腦部形態(tài)及褐脂質顆粒分布特征Fig.1 Distribution of lipofuscin and morphology in brain ofmantis shrimp Oratosquilla oratoria

注：A為口蝦蛄腦細胞；B為腦細胞核周圍形態(tài)；C為包被單層膜；D為褐脂質顆粒。N示細胞核；L示褐脂質；M示線粒體；PL示初級溶酶體；LY示次級溶酶體；V示囊泡；CY示細胞質；MB示細胞膜Note：A，the brain cell ofmantis shrimp Oratosquilla oratoria；B，the peri-nuclei of brain cell；C，monofilm；D，the granules of lipofuscin.N，nucleus；L，lipofuscin；M，mitochondrion；PL，primary lysosome；LY，secondary lysosome；V，vasica；CY，cytoplasm；MB，cellmembrane圖2　透射電鏡下口蝦蛄腦部形態(tài)特征Fig.2 Ultrastructural characterization of the brain in mantis shrimp Oratosquilla oratoria under a transm ission electron m icroscope

2.2 超微結構

從圖2-A、B可見，在透射電鏡下，可見橢圓形褐脂質顆粒，多聚集分布于近細胞核區(qū)域，與溶酶體類似，外被單層細胞器膜，染色密度較其他區(qū)域高且均勻；不同代謝累積階段褐脂質顆粒的染色程度不同，衰老細胞中褐脂質顆粒較深。此外，細胞核周圍常見分布著初級溶酶體 （PL）、次級溶酶體 （LY）、囊泡 （V）、線粒體 （M）、褐脂質顆粒（L）等。線粒體細胞被雙層膜包圍，內部染色程度不同，存在著較老的細胞易變性，自由基較多；初級溶酶體結構呈囊泡狀，直徑為0.2～0.5μm（圖2-C），是一種剛剛分泌的含有溶酶體酶的分泌小泡，此時酶處于一種非活性狀態(tài)，染色較淺，電鏡下多不明顯。次級溶酶體和褐脂質相似，包被單層膜 （圖2-D），但是體積比褐脂質顆粒稍小。由于溶酶體吞噬作用導致其內部很多物質會發(fā)生降解，其中很可能包括褐脂質。

3 討論

3.1 口蝦蛄腦部褐脂質的形態(tài)結構

褐脂質是細胞代謝產物在次級溶酶體中累積形成的［13］，是一種含有脂和蛋白質的黃褐色自發(fā)熒光物質，呈顆粒狀。隨著動物的生長，褐脂質顆粒會在體內不斷累積，尤其富集于腦部及周圍神經細胞中，關于水生無脊椎動物腦部組織形態(tài)以及褐脂質結構的研究較多［14］。口蝦蛄體內褐脂質顆粒主要累積于腦部，這與對其他甲殼類動物的描述一致［8］，說明腦部是研究褐脂質結構的重要部位。熒光顯微鏡下，口蝦蛄體內的褐脂質顆粒均勻分布于腦部；電子顯微鏡下，褐脂質與溶酶體類似，外被單層細胞器膜，染色密度較其他區(qū)域高，邊緣密度較中間區(qū)域染色較深。

口蝦蛄腦部組織切片制作較難，經高濃度酒精脫水很容易變脆，80％酒精脫水時可以適當加一滴甘油，減緩組織變脆；夏季切片時，為保持蠟塊硬度，可以將包埋好的蠟塊置于冰箱 （4℃）中保存。由于脫水時間不當和浸蠟時溫度過高導致的組織過硬，易造成切片破碎。

另外，在熒光顯微鏡下，在切片后未脫蠟及染色的口蝦蛄腦部組織中的黃色褐脂質顆粒清晰可見，這可用于快速測定口蝦蛄腦部褐脂質的含量。

3.2 口蝦蛄腦部主要成分與褐脂質關系及其作用

隨著動物的生長，腦部褐脂質逐漸累積，并呈密集、擴大、增厚的趨勢［15］。人類腦部發(fā)育過程中，成熟的褐脂質顆粒大多會擴充至細胞質甚至相鄰的細胞，核周質中大量囊泡可能形成重要的運輸機制。囊泡是由單層膜所包裹的膜性結構，主要功能是實現細胞內的膜性細胞器之間的物質運輸（如脂類），在神經細胞指令下可精確控制生物酶、神經遞質等分子傳遞的時間與位置［16］。研究表明，囊泡的運輸機制實現了褐脂質顆粒在細胞質中的累積，并從細胞質延伸到原生質膜，促使細胞中褐脂質顆粒逐步累積，這與人體衰老機制密不可分［17］。

褐脂質顆粒與溶酶體顆粒之間存在著顯著的相關性，二者在細胞中位置接近，均包被單層膜。Terman等［15］研究褐脂質形成機制時指出，溶酶體通過吞噬作用消除細胞內代謝廢物，褐脂質顆粒來自于溶酶體內部難降解物質的積累，包含褐脂質的次級溶酶體通常稱作殘體，這意味著它們并不積極地集成到酸性液泡中，當與其他溶酶體或者裂解酶結合時，就會集成變?yōu)樗嵝砸号莸囊徊糠?。目前沒有統一的證據表明，褐脂質在溶酶體內降解或者通過胞外分泌而消除，即使是在比較小的個體中，褐脂質顆粒也不會被完全消除。

此外，褐脂質顆粒的形成與線粒體也是密不可分的。由于細胞氧化磷酸化產生的有害氧自由基導致線粒體變性。因此，線粒體可能是褐脂質顆粒的主要來源之一［16］。透射電鏡下，褐脂質與線粒體位置非常接近，線粒體可見由雙層膜包被，內含染色濃度不同的嵴狀結構；褐脂質顆粒染色較深且均勻，近細胞核區(qū)域染色較深，由單層細胞器膜包被。二者都與生物新陳代謝有關，且新陳代謝速率越快，線粒體和褐脂質數量也就越多。

3.3 褐脂質與甲殼動物年齡之間的關系

年齡是一個重要的生物學參數，對研究甲殼動物生物學具有重要意義。大量研究表明，褐脂質與生物年齡間存在著重要聯系，褐脂質累積與年齡間存在高度的相關性，用褐脂質可以較準確地估計甲殼動物的年齡，國際上普遍采用褐脂質標志物鑒定甲殼類年齡特征［18-20］。由于甲殼動物蛻皮頻率和生長率不同，傳統上用體長、體質量來估計其年齡是不準確的［21］。因此，關于口蝦蛄體長、體質量與年齡的關系研究大多作為一種媒介，用來比較與褐脂質作為指標估計口蝦蛄年齡的準確性，研究表明，用褐脂質作為指標來估計口蝦蛄年齡的方法是準確而可靠的，其結果可為研究鑒定甲殼動物年齡提供參考。

綜上所述，本研究中報道了口蝦蛄腦部褐脂質組織學和超微結構，發(fā)現口蝦蛄腦部褐脂質形態(tài)不僅與其他甲殼動物有相似之處，也有其自身特點，如腦部褐脂質近似橢圓形，染色密度較其他區(qū)域高且均勻，初級溶酶體與囊泡結構較多。本研究結果可為口蝦蛄腦部褐脂質的進一步研究提供基礎資料，但有關甲殼動物口蝦蛄腦部褐脂質的形成過程及其與年齡的關系有待進一步研究。

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M orphology and histology of brain and ultrastructure and distribution of lipofuscin in brain ofmantis shrimp Oratosquilla oratoria

FAN Qing-song1，XING Kun1，LIU Hai-ying1，SUN Jing-xian2，CHEN Lei1，LIU Qi1
（1.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：Morphology and histology of brain and ultrastructure and distribution of lipofuscin in brain were investigated inmantis shrimp Oratosquilla oratoria by biopsy，fluorescentmicroscopy and transmission electron microscopy to research the characterization ofmorphology，distribution and ultrastructure of lipofuscin in the brain.The brain was found in the rear of ophthalmic segment and in the small sharp point of cephalothorax，and histologically the rounded cerebral nucleus with diameter of 10-30μm was distributed uniformly in the brain，especially aggregated in the protocerebral bridge cellmass.Under fluorescentmicroscopy，the lipofuscin granules with diameter of 1-3 μm were yellow-brown in color and uniformly distributed in the brain.The transmission electron microscope revealed that lipofuscin was similar to the lysosome in thatboth were covered by single-layered organellesmembrane，and in the granules filled with homogeneous electron-dense contents.The findings indicated that the lipofuscin granules in brain of the mantis shrimp had similar form to other crustaceans and uniform distribution in brain.

Key words：Oratosquilla oratoria；brain；lipofuscin；ultrastructure

中圖分類號：Q954.52

文獻標志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.005

文章編號：2095-1388（2016）02-0147-04

收稿日期：2015-05-18

基金項目：國家自然科學基金資助項目 （41006079）；農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題 （2014-MSENC-KF-17）

作者簡介：范青松 （1986—），男，碩士研究生。E-mail：1437937373@qq.com

通信作者：邢坤 （1984—），男，博士，副教授。E-mail：xingkun@dlou.edu.cn