毛明光，溫施慧，姜志強，蔣潔蘭，孫　航，呂繪倩，李　幸

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023）

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太平洋鱈神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白（CP）的原核表達及條件優(yōu)化

毛明光，溫施慧，姜志強，蔣潔蘭，孫航，呂繪倩，李幸

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023）

摘要：為深入研究太平洋鱈Gadusmacrocephalus神經(jīng)壞死病毒 （Pacific cod nervous necrosis virus，PCNNV）衣殼蛋白 （capsid protein，CP）的功能，將PCNNV cp基因連接到pET-32a原核表達載體中，構(gòu)建原核表達重組載體pEVCP，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21（DE3）表達系統(tǒng)中進行融合表達，對誘導(dǎo)劑 IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和溫度等誘導(dǎo)表達條件進行優(yōu)化，采用SDS-PAGE及質(zhì)譜技術(shù)鑒定表達產(chǎn)物。結(jié)果表明：本研究中成功構(gòu)建了重組載體pEVCP，表達的目的蛋白相對分子質(zhì)量約為55 000；目的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定，有6個肽段的氨基酸序列與預(yù)期一致；對重組菌株pEVCP/BL21的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.1 mmol/L、最佳誘導(dǎo)時間3 h、溫度30℃。本研究結(jié)果可為后續(xù)冷水魚類病毒疫苗的研制及病毒快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：太平洋鱈；神經(jīng)壞死病毒；衣殼蛋白；原核表達

太平洋鱈Gadusmacrocephalus俗稱大頭鱈，隸屬于鱈形目 Gadiformes、鱈科 Gadidae、鱈屬 Gadus，屬冷水性底層魚類。太平洋鱈是中國北方乃至世界重要的海洋經(jīng)濟魚類之一，近年來，由于過度捕撈以及環(huán)境污染等使其產(chǎn)量大幅降低。因此，太平洋鱈的人工育苗與增養(yǎng)殖技術(shù)問題亟待解決。目前，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室研究人員［1-4］已經(jīng)成功進行了太平洋鱈的人工繁育和周年飼養(yǎng)。但育苗早期會出現(xiàn)魚苗大量死亡的現(xiàn)象，仔、稚魚出現(xiàn)上浮于水面、急促螺旋狀游動等典型的神經(jīng)疾病癥狀，與其他魚類感染諾達病毒 （Nodavirus）的癥狀相似，經(jīng)顯微鏡觀察及分子生物學(xué)診斷，確診為魚類病毒性神經(jīng)壞死病 （viral nervous necrosis，VNN）［5］。

VNN又被稱為視網(wǎng)膜病及病毒性腦病 （viral encephalopathy and retinopathy，VER），該病被世界動物衛(wèi)生組織 （OIE）［6］列為重要的魚類病害，是世界性魚類流行性傳染病。該病的病原為β型諾達病毒，主要感染水產(chǎn)動物的神經(jīng)系統(tǒng)，造成病毒性神經(jīng)壞死，故該病毒也被稱為神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）。目前，NNV已在鰻鱺目Anguilliformes、鱸形目Perciformes、鰈形目Pleuronectiformes、鲀形目 Tetraodontiformes、鱈形目Gadiformes等40多種魚類中發(fā)現(xiàn)，其影響蔓延至亞洲、歐洲、澳洲和北美洲，給各國海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失［7-9］。但對VNN病還沒有特效治療藥物，考慮到化學(xué)藥物和抗生素的使用已受到限制，以及環(huán)境和食品的安全，VNN病目前還以預(yù)防為主。防治VNN等病毒性傳染病最有效的途徑之一是研制特異性疫苗，該疫苗的抗原即為病毒衣殼蛋白 （capsid protein，CP）。由于傳統(tǒng)的滅活天然病毒和弱毒疫苗在安全性等方面存在問題，而病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)亦尚未成熟，因此，基因工程疫苗作為新型疫苗是未來研究和發(fā)展的方向。

NNV基因組由2條非聚腺苷酸化、正義的RNA1和RNA2單鏈構(gòu)成［10］，RNA1主要編碼非結(jié)構(gòu)A蛋白，是依賴RNA的聚合酶；RNA2編碼病毒CP，其序列大小為1300～1400 bp［11］。作者的前期研究結(jié)果顯示，冷水性和暖溫性魚類中NNV基因組存在明顯差異［5］。目前，暖水性魚類NNV病毒疫苗已經(jīng)開始研制［12］，而冷水性魚類病毒疫苗的研究尚未見報道。本研究中，根據(jù)太平洋鱈神經(jīng)壞死病毒 （Pacific cod nervous necrosis virus，PCNNV）衣殼蛋白 （CP）基因的核苷酸序列 （Genbank登錄號：KM576685），構(gòu)建重組表達載體pEVCP，將其轉(zhuǎn)化至表達菌株E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，優(yōu)化重組蛋白誘導(dǎo)表達條件，以期為后續(xù)研制冷水性魚類病毒疫苗和開發(fā)病毒快速檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)，為成功實現(xiàn)太平洋鱈人工繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 從含有PCNNV RNA2核苷酸序列完整開放閱讀框 （open reading frame，ORF）的克隆菌株中提取質(zhì)粒，命名為pMD-NNV，由農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室提供；克隆菌株E.coli DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達載體 pET-32a和表達菌株 E.coli BL21 （DE3）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 LA Taq聚合酶、NcoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程 （大連）有限公司；T4 DNA連接酶購自New England Biotech（北京）有限公司；QIAquick Gel Extraction膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；氨芐青霉素 （Amp）購自生工生物工程 （上海）股份有限公司；誘導(dǎo)劑IPTG、EasyPure PlasmidMiniPrep質(zhì)粒提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder和 2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白Ladder購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的 PCR擴增與回收 根據(jù) PCNNV cp基因序列特點和pET-32a表達載體上的NcoⅠ和NotⅠ酶切位點，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對特異性引物：

其中，限制性內(nèi)切酶的酶切位點用下劃線表示，終止密碼子前引入的組氨酸 （His）標(biāo)簽序列用方框表示。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

以pMD-NNV質(zhì)粒為模板，F(xiàn)1和R1為上、下游引物，擴增病毒CP編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系 （共20.0μL）：滅菌雙蒸水9.6μL，10×LA Taq Buffer Ⅱ （Mg2+Plus） 2.0μL，dNTPMixture（2.5 mmol/L each）3.2μL，上、下游引物 （終濃度1.0μmol/L）各2.0μL，pMD-NNV質(zhì)粒1.0μL，LA Taq（TaKaRa）（5 U/μL）0.2μL。PCR反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性3min；94℃下變性30 s，56℃下退火1 min，72℃下延伸90 s，共進行30個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行電泳，并回收純化特異性片段，參照QIAquick凝膠試劑盒使用說明書方法進行。

1.2.2 重組表達載體pEVCP的連接和轉(zhuǎn)化 將上述純化的目的片段和pET-32a表達載體分別用NcoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效率并回收純化酶切后的目的片段和載體。用T4連接酶將回收后具有相同NcoⅠ和NotⅠ黏性末端的載體和目的基因片段按摩爾比為1∶5進行連接。反應(yīng)體系 （共20.0μL）：10×T4 Buffer2.0μL，載體pET-32a 3.0μL，目的基因DNA 4.6μL，T4 DNA Ligase 1μL，用RNasefree H2O補足至總體積20μL。在25℃條件下水浴40 min，連接產(chǎn)物即為構(gòu)建的重組表達載體 pEVCP。將pEVCP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有Amp（100μg/m L）的LB瓊脂平板上，于37℃下倒置過夜培養(yǎng)。

1.2.3 重組表達載體pEVCP的篩選與鑒定 采用PCR法快速鑒定陽性克隆，將擴增片段大小符合的菌液送至英濰捷基 （上海）貿(mào)易有限公司進行測序。經(jīng)測序檢測無誤后的菌液，按北京全式金質(zhì)粒提取試劑盒說明書抽提質(zhì)粒。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與質(zhì)譜鑒定 向表達菌株E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中轉(zhuǎn)入上述pEVCP質(zhì)粒，得到含重組基因的原核重組菌，命名為pEVCP/BL21，涂布于LB瓊脂平板 （含100 μg/mL Amp、0.5％葡萄糖）上，于37℃下培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌株，接種于20 mL LB培養(yǎng)基（含100μg/m L Amp）中，于37℃、200 r/min搖床上培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～1.0。按1∶50比例把菌液再轉(zhuǎn)移至新鮮 LB培養(yǎng)基 （含 100μg/mL Amp）中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，當(dāng)OD600nm值約為0.6時停止培養(yǎng)。留出部分菌液不加誘導(dǎo)劑作為對照組，剩余菌液加入終濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，培養(yǎng)3 h。分別收集有無誘導(dǎo)劑的菌液1mL，以5000×g離心5 min，棄去上清液，用100 μL pH為8.0的PBS充分懸浮菌體，然后加入1× SDS上樣緩沖液，再煮沸5～10 min，以12 000 r/min離心5 min，用SDS-PAGE電泳檢測上清液，確認菌體目的蛋白是否表達。并將誘導(dǎo)表達的目的條帶切膠送至生工生物工程 （上海）股份有限公司采用Maldi-TOF-TOF法進行質(zhì)譜鑒定。

1.2.5 重組菌株pEVCP/BL21原核表達條件的優(yōu)化

（1）誘導(dǎo)劑IPTG濃度的優(yōu)化。將擴大培養(yǎng)的菌液分裝于8個50 mL錐形瓶中，每瓶分裝10 mL，先留出1瓶不做任何處理，作為空白對照。剩余7瓶再取1瓶不加IPTG，其余分別加入終濃度為0.01、0.1、0.5、1、3、5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，將上述7瓶菌液分別在28℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)3 h。取樣進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白表達量。

（2）誘導(dǎo)時間的優(yōu)化。將擴大培養(yǎng)的菌液分裝于7個50 mL錐形瓶中，每瓶分裝10 mL，先留出1瓶不做誘導(dǎo)表達，剩余各瓶菌液加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為 1 mmol/L，在 28℃、180 r/min搖床上分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h。取樣進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白表達量。

（3）誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化。將擴大培養(yǎng)的菌液分裝于7個50 mL錐形瓶中，每瓶分裝10 mL，先留出1瓶不做誘導(dǎo)表達，剩余各瓶菌液加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為1 mmol/L，在180 r/min搖床上培養(yǎng)3 h，培養(yǎng)溫度分別為22、26、28、30、34、37℃。取樣進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體pEVCP的構(gòu)建與鑒定

以F1和R1為上、下游引物，pMD-NNV質(zhì)粒為模板，進行PCNNV cp基因的擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增出一條1000 bp左右的條帶（圖1-A），條帶大小與預(yù)期相符，表明PCR擴增出了目的片段。

將pET-32a表達載體和純化的目的片段分別用NcoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切。酶切前的pET-32a質(zhì)粒為環(huán)狀 （圖1-B），NcoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶在質(zhì)粒上的位點僅相差46 bp，故酶切后的片段在5000 bp左右 （圖1-C），與實際大小相符。擴增目的片段的引物酶切位點在兩端，故酶切后片段大小幾乎不變，仍為1000 bp（圖1-D）。

重組表達載體pEVCP經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、PCR鑒定，得到陽性克隆片段長度約1600 bp（圖1-E），與預(yù)期相符。測序結(jié)果與已知PCNNV cp基因ORF的序列一致，表明重組表達載體pEVCP構(gòu)建成功。

注：M1為1 kb DNA Ladder；M2為DL2000 DNA Marker；1為PCNNV cp基因擴增產(chǎn)物；2為酶切前的pET-32a質(zhì)粒；3為pET-32a經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切后的產(chǎn)物；4為PCNNV cp經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切后的產(chǎn)物；5、6、7、8分別為pEVCP重組表達載體陽性克隆Note：M1，1 kb DNA Ladder；M2，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification of PCNNV cp gene；2，plasmid pET-32a；3，plasmid pET-32a digested with NcoⅠand NotⅠ；4，PCNNV cp gene digested with NcoⅠand NotⅠ；5，6，7，8，postive clone of pEVCP圖1　重組表達載體pEVCP的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of recombinant vector p lasm id pEVCP

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與質(zhì)譜鑒定

SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，pEVCP/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在蛋白相對分子質(zhì)量為55 000處出現(xiàn)特異性表達，與預(yù)期相符（圖2）。

切取目標(biāo)條帶進行質(zhì)譜檢測，采用Mascot與NCBInr數(shù)據(jù)庫進行搜索和對比，結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白酶解的肽段中有7個肽段歸屬于一個蛋白，這些肽段的序列與數(shù)據(jù)庫中大西洋鱈Gadusmorhua NNV CP的序列相匹配，其中有4個肽段的可信度單獨超過閾值分數(shù)，這些匹配的肽段序列在其蛋白序列中覆蓋度為24％。上述7個肽段中有6個肽段的序列與太平洋鱈NNV基因推導(dǎo)的氨基酸序列完全匹配 （圖3），肽段與其在推導(dǎo)氨基酸序列中的位置見表1。由此可見，SDS-PAGE膠上的特異性表達帶為重組衣殼蛋白。SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，PCNNV cp基因在重組菌BL21中得到了正確表達。

注：M為蛋白Ladder；1為未經(jīng)誘導(dǎo)的pEVCP/BL21全菌蛋白；2為經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h的全菌蛋白 （箭頭所示為重組目的蛋白條帶）Note：M，protein Ladder；1，non-induced sample；2，protein expression induced by 1 mmol/L IPTG for 3 h圖2　重組蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達Fig.2 Expression of recombinant capsid protein in Escherichia coli BL21（DE3）

注：標(biāo)有核質(zhì)比的6個峰表示檢出的與太平洋鱈神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白相匹配的肽段Note：The peaksmarked with mass corresponded to the 6 peptides which match with PCNNV CP圖3　重組蛋白的質(zhì)譜鑒定Fig.3 M ass spectrum of the recom binant capsid protein

表1　與推導(dǎo)的太平洋鱈神經(jīng)壞死病毒氨基酸序列相匹配的肽段序列及位置Tab.1 　Sequences and locations of the peptides which match w ith the deduced am ino acid sequence of PCNNV CP

2.3 重組菌株pEVCP/BL21誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)劑IPTG濃度 重組菌株pEVCP/BL21

經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后目的蛋白具有明顯的表達。不同濃度IPTG對蛋白表達量的影響結(jié)果如圖4所示，空白對照組 （未經(jīng)處理）和未添加IPTG培養(yǎng)3 h組的菌液中目的蛋白均未出現(xiàn)明顯的表達，未添加IPTG的菌液經(jīng)28℃下培養(yǎng)3 h后，僅在濃度上明顯比空白對照組大，其余IPTG濃度菌液中目的蛋白均出現(xiàn)大量的表達，除0.01 mmol/L組目的蛋白的表達量相對較少外，其他高誘導(dǎo)劑濃度組目的蛋白表達量差異不明顯，但除目的蛋白以外的蛋白條帶的顏色隨IPTG濃度升高而變淺，推測加入過量的誘導(dǎo)劑可能會導(dǎo)致細胞死亡。因此，誘導(dǎo)劑IPTG的最佳添加濃度為0.1 mmol/L。

注：M為蛋白Ladder；1為空白對照組；2為未添加IPTG的培養(yǎng)組；3～8分別為重組菌pEVCP/BL21在0.01、0.1、0.5、1、3、5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑濃度下的表達Note：M，protein Ladder；1，blank control；2，pEVCP/BL21 cultured without addition of IPTG；3-8，expression of pEVCP/BL21 induced by 0.01，0.1，0.5，1，3 mmol/L and 5 mmol/L IPTG，respectively圖4　誘導(dǎo)劑IPTG濃度對pEVCP/BL21表達影響的SDS-PAGEFig.4 Expression of pEVCP/BL21 induced by different IPTG concentrations analyzed by SDS-PAGE

2.3.2 誘導(dǎo)時間 不同誘導(dǎo)時間 （1、2、3、4、5、6 h）對蛋白表達量的影響結(jié)果如圖5所示，目的蛋白在誘導(dǎo)1 h后即開始表達，且在1～3 h時表達量隨誘導(dǎo)時間的增加而增多，3 h后表達量趨于穩(wěn)定。因此，最佳誘導(dǎo)時間為3 h。

注：M為蛋白Ladder；1為pEVCP/BL21未誘導(dǎo)；2～7分別為重組菌在1、2、3、4、5、6 h誘導(dǎo)時間下的表達Note：M，protein Ladder；1，blank control without induction by pEVCP/BL21；2-7，expression of recombinantbacteria induced for 1，2，3，4，5 h and 6 h，respectively圖5　誘導(dǎo)時間對 pEVCP/BL21表達影響的 SDSPAGEFig.5 Expression of pEVCP/BL21 induced for differen t hours analyzed by SDS-PAGE

2.3.3 誘導(dǎo)溫度 不同誘導(dǎo)溫度 （22、26、28、30、34、37℃）對目的蛋白表達量的影響如圖6所示，在22～30℃時，目的蛋白的表達量隨溫度的升高而增多，表達量最高值出現(xiàn)在30℃，高溫組 （34℃和37℃）蛋白表達量與30℃組無明顯差異，但溫度過高時雜蛋白的量增多。因此，最適誘導(dǎo)溫度為30℃。

注：M為蛋白Ladder；1為pEVCP/BL21未誘導(dǎo)；2～7分別為重組菌在22、26、28、30、34、37℃誘導(dǎo)溫度下的表達Note：M，protein Ladder；1，blank control without induction by pEVCP/BL21；2-7，expression of recombinant bacteria induced at 22，26，28，30，34℃ and 37℃，respectively圖6　誘導(dǎo)溫度對 pEVCP/BL21表達影響的 SDSPAGEFig.6 Expression of pEVCP/BL21 induced at different temperature analyzed by SDS-PAGE

對誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度條件優(yōu)化的結(jié)果表明，以上條件對重組載體的原核表達均有影響。通過對目的蛋白含量的分析 （圖4～圖6），得出IPTG對重組菌株pEVCP/BL21的最佳誘導(dǎo)條件：IPTG濃度為0.1 mmol/L、時間為3 h、溫度為30℃。

3 討論

諾達病毒科可分為主要感染昆蟲的α諾達病毒屬以及主要感染魚類的β諾達病毒屬。β諾達病毒直徑僅為25～30 nm，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小魚類病毒［13］。根據(jù)25種β諾達病毒的外殼蛋白基因序列，魚類NNV可分為4種基因型：赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒 （redspotted grouper NNV，RGNNV），紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒 （tiger puffer NNV，TPNNV），條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒 （barfin flouder NNV，BFNNV），黃帶鲹神經(jīng)壞死病毒 （stfiped jack NNV，SJNNV）［14］。目前，在中國所報道的NNV均屬于RGNNV。β諾達病毒衣殼蛋白含有大量抗原表位，據(jù)報道，試驗表達出的重組蛋白具有良好的抗原特異性，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體并起到保護作用［15-18］，因此，可通過體外表達 NNV CP研制抗病毒疫苗。NNV CP復(fù)制所依賴的聚合酶校正能力弱而易導(dǎo)致突變，故不同宿主針對NNV會產(chǎn)生不同的細胞表面受體表位。基于NNV的這一特點，為了提高保護效率必須研制有針對性的疫苗［19］。本實驗室在前期工作中已獲得太平洋鱈NNV RNA2核苷酸序列，并將該序列與β諾達病毒屬其他幾種病毒的cp核苷酸序列進行分子進化分析，得出太平洋鱈NNV病毒株是BFNNV血清型的成員。為了深入研究太平洋鱈NNV cp基因的功能及研制有效疫苗，本研究中將其基因重組到表達載體pET-32a中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21 （DE3）原核表達系統(tǒng)中，成功地表達了重組蛋白。

3.1 表達系統(tǒng)與表達載體的選擇

為了獲得高表達量的重組蛋白，通常需要建立基因的高效表達系統(tǒng)。目前，常用的蛋白表達系統(tǒng)有哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng) （大腸桿菌E.coli表達系統(tǒng)）。其中，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景研究較透徹、細胞繁殖快速、培養(yǎng)周期短和產(chǎn)量高等優(yōu)點，已成為高效表達的首選體系［20］。截至2009年，美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局所批準(zhǔn)的生物制藥中，大腸桿菌作為表達宿主以重組蛋白的藥品占29.8％［21］。而在表達NNV cp基因的相關(guān)報道中，迄今為止，只有羅衛(wèi)等［22］將青石斑魚 NNV cp基因插入到桿狀病毒Bac-To-Bac表達系統(tǒng)，在昆蟲細胞中進行表達，其余的以采用原核表達系統(tǒng)的居多［15-16，23］。從目的蛋白應(yīng)用的因素考慮，盡管將大腸桿菌表達的蛋白用于體內(nèi)時，具有缺乏轉(zhuǎn)譯后修飾、有內(nèi)毒素和重組蛋白空間構(gòu)象改變的缺點，但蛋白自然空間構(gòu)象對制備多克隆抗體血清并不起決定性作用，故本研究中采用大腸桿菌 BL21（DE3）來表達重組蛋白。

表達系統(tǒng)的核心是表達載體，在大腸桿菌表達外源基因時，pET載體系統(tǒng)是目前最理想的原核載體之一，其優(yōu)點除了表達量高外，還可增加表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性和免疫原性，更利于表達產(chǎn)物的有效回收與純化［24］。大腸桿菌載體的表達分為非融合型表達、融合型表達和分泌型表達3種［25］。本試驗中，采用的 pET-32a屬于大腸桿菌融合型表達中的純化標(biāo)簽融合系統(tǒng)，將His標(biāo)簽置于表達載體中表達，使蛋白的檢測和純化更為容易，且pET-32a原核表達載體已經(jīng)被廣泛商用，重組蛋白的應(yīng)用門檻較低。PCNNV cp基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量理論大小為37 000，但因插入pET-32a的目的基因和載體自身帶的一段編碼硫氧還蛋白的序列及6 個His標(biāo)簽序列 （相對分子質(zhì)量為18 300的多肽）一起融合表達，因此，表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量是三者之和，約為55 000。

3.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

影響外源基因在大腸桿菌中表達的因素，除了載體類型、宿主菌特征之外，還包括營養(yǎng)狀況和培養(yǎng)條件等。即使用相同的原核表達體系也會有完全不同的外源蛋白誘導(dǎo)條件，故優(yōu)化對應(yīng)的誘導(dǎo)條件是提高外源蛋白表達量的必要途徑［26-27］。本試驗中，誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mmol/L時蛋白的表達量已達到最高值，隨著IPTG濃度繼續(xù)升高，目的蛋白的表達量無顯著變化，但其他蛋白的表達量卻出現(xiàn)降低，可能是由于誘導(dǎo)劑對大腸桿菌代謝的毒性作用增強［20］。誘導(dǎo)時間為3 h時，目的蛋白的表達量達到最大，且不再隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加。溫度在誘導(dǎo)過程中可能會影響酶的活性和氧的溶解度，本試驗中，誘導(dǎo)溫度升至30℃時目的蛋白表達量已達到最高，高溫 （34、37℃）下蛋白表達量與30℃時無明顯差異，且溫度過高不僅雜蛋白比例升高，還會使一些蛋白累積形成包涵體。從經(jīng)濟、時間角度考慮，本研究中重組菌pEVCP/BL21表達融合蛋白的最適條件為：IPTG終濃度 0.1 mmol/L、誘導(dǎo)時間3 h、誘導(dǎo)溫度30℃。

3.3 重組蛋白的鑒定

對于基因工程中表達動物蛋白的檢測方法，蛋白質(zhì)譜鑒定是基于Western blot和Elisa傳統(tǒng)檢測方法基礎(chǔ)上的新興檢測技術(shù)。采用質(zhì)譜鑒定中MALDI-TOF-TOF測得肽指紋圖譜的方式鑒定蛋白質(zhì)，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中普遍應(yīng)用的方法［28］。進一步質(zhì)譜檢測SDS-PAGE膠上特異條帶結(jié)果顯示，獲得的6個肽段的氨基酸序列與太平洋鱈NNV cp基因推導(dǎo)的氨基酸序列完全匹配，證明該基因在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中獲得了成功表達。

綜上所述，本研究中將太平洋鱈NNV cp基因成功導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，經(jīng)過優(yōu)化得出PCNNV CP蛋白的最佳表達條件。本研究結(jié)果可為后續(xù)冷水魚類病毒疫苗的研制及病毒快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and condition optim ization of nervous necrosis virus capsid protein（CP）in Pacific cod Gadusmacrocephalus

MAO Ming-guang，WEN Shi-hui，JIANG Zhi-qiang，JIANG Jie-lan，SUN Hang，LüHui-qian，LIXing
（Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Fish Applied Biology and Aquaculture in North China，Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：Capsid protein（CP）gene of nervous necrosis virus in Pacific cod Gadusmacrocephalus（PCNNV）was inserted into plasmid pET-32a to construct recombinant plasmid pEVCP to further study the function of PCNNV CP，and to devise an effective vaccine for PCNNV.The recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL21（DE3），and then induced under conditions of different IPTG concentrations，time and temperature.The expressed products were identified by SDS-PAGE and mass spectrum analysis.Results showed that the recombinant plasmid pEVCP was constructed successfully and a protein with molecular weight of 55 000 was identified using SDS-PAGE.6 peptide segments of recombined CPwere sequenced correctly usingmass spectrum.The expression levelwas varied under different induced conditions，with the optimal expression under conditions of 0.1 mmol/L IPTG，3 h and 30℃.The findings would contribute to exploration of nervous necrosis virus（NNV）vaccine and development of rapid detection kit for NNV.

Key words：Gadusmacrocephalus；nervous necrosis virus；capsid protein；prokaryotic expression

中圖分類號：Q786

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.001

文章編號：2095-1388（2016）02-0117-07

收稿日期：2015-06-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目 （31302202）；國家 “863”計劃項目 （2012AA10A413）；農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題 （2014-MSENC-KF-12）；遼寧省教育廳科研項目 （L2013276）

作者簡介：毛明光 （1982—），男，博士，副教授。E-mail：mmg@dlou.edu.cn

通信作者：姜志強 （1960—），男，教授。E-mail：zhqjiang@dlou.edu.cn