張 旭陳振江（ 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600；2 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065）

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一種改良的薄層等電聚焦電泳新方法

張 旭1陳振江2*
（1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065）

【摘要】目的 介紹一種高效新穎的IFE方法。方法 采用簿層等電聚焦電泳。結(jié)果 該方法簡(jiǎn)便實(shí)用，并可節(jié)省昂貴試劑的用量。結(jié)論 此方法可用于藥物蛋白質(zhì)成分的研究。

【關(guān)鍵詞】凝膠；聚丙烯酰胺凝膠電泳；十二烷基硫酸鈉-PAGE；等電聚焦電泳

等電聚焦電泳（IFE）是將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)其處在低于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中則帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)；若其處在高于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中，則帶負(fù)電向正極移動(dòng)。當(dāng)泳動(dòng)到其自身特有的等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，泳動(dòng)速度下降到零，具有不同等電點(diǎn)的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點(diǎn)位置，形成一個(gè)個(gè)清晰的區(qū)帶，分辨率極高。此外，由于分離所需時(shí)間短，分子擴(kuò)散作用較小，分離結(jié)束后能回收被分離的樣品物質(zhì)，故在中藥成分分析及中藥材真?zhèn)舞b別上有著廣泛而良好的應(yīng)用前途。在進(jìn)行IFE過程中，雖然分辨率會(huì)隨電泳時(shí)間的延長(zhǎng)和工作電壓的升高而提高，但工作電壓的升高也會(huì)使pH梯度衰變加快，需采用相應(yīng)的技術(shù)措施來解決。

為降低pH梯度緩沖液在較高工作電壓下的“衰變”，可采用如下措施：①選用適宜的兩性電解質(zhì)。理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，以保證其穩(wěn)定的pH梯度和允許一定的電流通過。兩性電解質(zhì)的分子量要盡可能小，以保證被分離的高分子物質(zhì)通過分子篩或透析方法得以分開，同時(shí)所選用的電解質(zhì)不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。目前，普遍應(yīng)用的兩性電解質(zhì)有3種規(guī)格，分別適用于pH 3～10、pH 4～10、pH 5～7。②調(diào)節(jié)陽極電解液的pH值以改變pH梯度。如在控制電解質(zhì)本身的濃度時(shí)，通過加入離子型表面活性劑來增加電解液的導(dǎo)電性，以促進(jìn)適宜的較“平坦”的pH梯度的形成。③用緩沖劑聚焦電泳可制備包含待分離樣品中狹窄的等電點(diǎn)在內(nèi)的水平pH梯度。如陳振江應(yīng)用PAGE、SDS-PAGE及IFE系列電泳技術(shù)研究鑒別了青箱子、阿膠、菊花、射干、土鱉蟲、山藥、白術(shù)、半夏等中藥[1-8]。此外，為了產(chǎn)生相應(yīng)的pH梯度，將已聚合的膠放在由0.1 mol/L H3PO4和0.1 mol/L NaOH組成的電極液中預(yù)泳1 h，然后取紫蘇子及其偽品薺荸子的樣品液各10 μL，點(diǎn)于膠上電泳2 h。結(jié)果顯示在靠近堿性、中性或酸性的各個(gè)區(qū)域，紫蘇子與薺荸子的電泳譜帶完全不同，實(shí)現(xiàn)了二者的鑒別[9]。實(shí)驗(yàn)中使用的兩性電解質(zhì)Ampholyte是一種脂肪族多胺基多羧基的混合物，一般為40%的水溶液，電聚焦的用量通常為1%～2%。試驗(yàn)表明，兩性電解質(zhì)用量小時(shí)，電聚焦后形成的pH梯度寬于其本身的pH梯度；相反，用量大時(shí)，電聚焦后形成的pH梯度近似其本身的pH梯度。因此，要提高分辨率，兩性電解質(zhì)的用量應(yīng)仔細(xì)斟酌。此外，電聚焦的時(shí)間直接影響pH梯度的變化。時(shí)間過長(zhǎng)或過短都不會(huì)產(chǎn)生平滑的曲線。所以，電聚焦的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，才能得到分辨率高的電泳圖譜。一般電泳時(shí)間以6～7 h為宜。

為節(jié)省試劑用量，簡(jiǎn)化操作，同時(shí)有利于電泳圖譜的保存，本文介紹由實(shí)驗(yàn)課題組自行設(shè)計(jì)的薄層等電聚焦電泳裝置及其操作技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

自行組裝薄層等電聚焦電泳模板一套；230型精密pH計(jì)（美國奧立龍）；離心機(jī)；丙烯酰胺、磷酸、N-N亞甲基雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、乙二胺、pH 4～10兩性電解質(zhì)均為AR級(jí)試劑；水為三蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制膠方法：凝膠母液及電極緩沖液的配制見表1。將凝膠以簿層（其厚度相當(dāng)投影膠片的厚度）的形式，附著在玻璃片上，玻璃片的背面距長(zhǎng)邊1 cm處，用標(biāo)記筆畫一橫線，作為上樣基準(zhǔn)線。

表1 聚丙烯酰胺凝膠的配方

2.2 上樣方法：將定量濾紙剪成芝麻粒大小，裝入干燥潔凈是培養(yǎng)皿中。上樣時(shí)用尖頭鑷子夾上一粒浸入樣品液中，取出后放在凝膠的基準(zhǔn)線上即可。在10 cm×5 cm的玻璃片上可上樣12～25個(gè)樣品。

2.3 加電極緩沖液的方法：由于簿層等電聚焦電泳需用的試劑量很小，所以電極緩沖液只需50～100 mL，裝在滴瓶中，電泳過程中只需間斷的將電極液滴到緊靠凝膠的濾紙條頭即可。

2.4 電泳使用的電泳槽為兩片厚1 cm的有機(jī)玻璃塊（10 cm×5 cm），中間鉆兩個(gè)孔，用以裝正負(fù)電極柱；在長(zhǎng)的一邊距邊1 cm處開槽（10 cm× 0.2 cm），其邊沿上鋪設(shè)鉑金絲。

2.5 實(shí)驗(yàn)裝置見圖1，最下方是一個(gè)30 cm×20 cm的搪瓷盤，內(nèi)裝冰塊以消除電泳過程中產(chǎn)生的熱；搪瓷盤上面是一塊35 cm×25 cm的普通玻璃，玻璃上是一個(gè)硅膠墊片（中間是一個(gè)恰好與玻璃片大小相同的空格） 。

圖1 簿層等電聚焦電泳裝置

3 結(jié)果討論

3.1 該方法簡(jiǎn)便實(shí)用，即可節(jié)省昂貴試劑的用量，又可在一塊凝膠上作多品種藥物的研究。所得電泳圖譜即可長(zhǎng)久保存，又可由電泳圖譜鑒別藥物真?zhèn)危瑫r(shí)可以測(cè)定藥物所含主要蛋白質(zhì)成分等電點(diǎn)。

3.2 在測(cè)定未知樣品的等電點(diǎn)時(shí)，可先采用pH=3～10的兩性電解質(zhì)，在初步測(cè)出等電點(diǎn)之后，改用包括樣品pI值的、窄pH范圍的兩性電解質(zhì)。為形成平滑的pH梯度并節(jié)省兩性電解質(zhì)的用量，可將占載體總量10%的pH=5～8的兩性電解質(zhì)加入pH=3～10的兩性電解質(zhì)中，由此可提高分辨率。

3.3 電泳使用的玻璃片必須潔凈，并用6 μL /100 mL硅酮溶液浸泡，晾干后制膠。這樣做的目的在于防止電泳后凝膠片的變形和開裂。

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中圖分類號(hào)：R-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）09-0026-02

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20122133120006），遼寧省自然基金項(xiàng)目（201202153），遼寧省教育廳一般項(xiàng)目（L2012350）

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