鄭鐵鑫 張影 柴華 尹堯 付麗杰/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

?

豬血清對(duì)豬肺炎支原體培養(yǎng)影響的研究

鄭鐵鑫 張影 柴華 尹堯 付麗杰/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

一、材料

（一）菌株

1.豬肺炎支原體P-5722-3株，由美國(guó)碩騰動(dòng)物保健公司提供，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保藏。

2.豬肺炎支原體P-5722-3株CCU陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品（CCU檢測(cè)），由美國(guó)碩騰動(dòng)物保健公司提供，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保藏。

（二）完全培養(yǎng)基

1.培養(yǎng)基組分A：根據(jù)豬肺炎支原體P-5722-3株培養(yǎng)基配方要求，制備組分A。

2.培養(yǎng)基組分B：豬血清

3.豬肺炎支原體P-5722-3株完全培養(yǎng)基由培養(yǎng)基組分A與培養(yǎng)基組分B共同制備，培養(yǎng)基組分A由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司采用無(wú)菌過(guò)濾方式制備，培養(yǎng)基組分B采用熱滅活方式制備。

（三）無(wú)菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基

酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P），均由本公司培養(yǎng)基班組提供。

（四）設(shè)備

恒溫振蕩器：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司SPH-211C

PH計(jì)： METTER TOLEDO FE 20C

二、方法

（一）試驗(yàn)方法

針對(duì)培養(yǎng)組分B，分別選擇5種豬血清，進(jìn)口豬血清1#（美國(guó)產(chǎn)）、進(jìn)口豬血清2#（新西蘭產(chǎn)）、國(guó)產(chǎn)豬血清3#、國(guó)產(chǎn)豬血清4#、國(guó)產(chǎn)豬血清5#，各2個(gè)批次，按培養(yǎng)基總量10%與培養(yǎng)基組分A制備成豬肺炎支原體完全培養(yǎng)基，進(jìn)行平行培養(yǎng)試驗(yàn)，豬血清在使用前均采用56℃，30 min熱滅活處理。

（二）培養(yǎng)方法

取豬肺炎支原體P-5722-3株菌株按10%接種完全培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，每隔8 h檢測(cè)一次PH值，當(dāng)PH值接近6.8時(shí)，將檢測(cè)時(shí)間縮短，直至PH值到達(dá)6.8左右時(shí)，取少量樣品進(jìn)行檢測(cè)并傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)三代并分別進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

（三）菌液濃度測(cè)定方法

采用CCU法（顏色變化單位測(cè)定法），該方法是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來(lái)計(jì)算微生物的相對(duì)含量，取51支無(wú)菌培養(yǎng)管，每一管裝1.8 ml豬肺炎支原體完全培養(yǎng)基（含有酚紅）；在第一管加入0.2 ml待測(cè)豬肺炎支原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2 ml加入到第二管，以此類推，10倍梯度稀釋，直到最后一管，做好標(biāo)記，進(jìn)行五組；采用同樣的方法對(duì)CCU陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，最為陽(yáng)性對(duì)照，取未接種的一管作為陰性對(duì)照，置于37℃振蕩培養(yǎng)14～16 d，根據(jù)顏色變化情況計(jì)算CCU含量。

三、結(jié)果

1.進(jìn)行3次5組平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3。

（備注：豬肺炎支原體P-5722-3株CCU陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)區(qū)間值在0.2×108ccu50/ml～1×108ccu50/ml）

2.五種豬血清搖瓶試驗(yàn)結(jié)果。

1.三組平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)較大性偏差，數(shù)據(jù)可信，可作為參考性依據(jù)。

2.通過(guò)分別選擇2各批次血清進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，降低批次間血清差異影響因素。

3.通過(guò)表1、表2、表3可以看出，豬肺炎支原體P-5722-3株使用進(jìn)口1#豬血清制備的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好。

四、小結(jié)與討論

1.美國(guó)產(chǎn)進(jìn)口1#豬血清與新西蘭產(chǎn)進(jìn)口2#豬血清批間差異較小，在培養(yǎng)上表現(xiàn)均較好，尤其是美國(guó)產(chǎn)進(jìn)口1#豬血清最為突出。

2.國(guó)產(chǎn)4#豬血清較國(guó)產(chǎn)3#豬血清與國(guó)產(chǎn)5#豬血清要好，但其批間差異較大。

3.豬肺炎支原體P-5722-3株菌株不管在進(jìn)口血清還是在國(guó)產(chǎn)血清中，連續(xù)三代培養(yǎng)呈現(xiàn)培養(yǎng)結(jié)果（CCU）上升趨勢(shì)。

4.通過(guò)三組平行試驗(yàn)，驗(yàn)證了豬血清作為培養(yǎng)組分B在培養(yǎng)過(guò)程中的重要性，選擇出最為適合豬肺炎支原體P-5722-3株菌株生長(zhǎng)的豬血清。

表1 五種不同血清制備的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后一代菌液濃度測(cè)定

表2 五種不同血清制備的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后二代菌液濃度測(cè)定

表3 五種不同血清制備的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后三代菌液濃度測(cè)定