董利平　崔玉環(huán)　趙寶民　連晶晶　魏玉磊　顏　娟　鄭茂東　劉占礦

河北北方學院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000)

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柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對大鼠腦缺血/再灌注損傷中PARP-1表達的影響*

董利平崔玉環(huán)趙寶民連晶晶魏玉磊顏娟鄭茂東劉占礦△

河北北方學院附屬第一醫(yī)院(張家口 075000)

摘要目的：探討柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對二磷酸腺苷核糖多聚酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)表達的影響。方法：將健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組、PARP-1抑制劑PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組，按再灌注時間點不同分為6h、12h、24h、48h、72h五個亞組；應用修飾酶循環(huán)法檢測NAD+濃度，定量RT-PCR技術檢測PARP-1 mRNA表達。結果：模型組NAD+濃度較假手術組明顯降低(P<0.01)，PARP mRNA表達顯著增加(P<0.01)，于再灌注24 h達高峰；藥物干預組NAD+濃度較模型組顯著增加(P<0.01)，PARP mRNA表達顯著降低(P<0.01)，并于24h表達最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)。結論：我們推測柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷可能是通過抑制MCAO大鼠PARP-1表達，降低NAD+消耗，實現(xiàn)其對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用。

主題詞腦缺血/中醫(yī)藥療法動物，實驗大鼠

腦缺血/再灌注損傷中PARP-1過度激活可導致NAD+大量耗竭、ATP減少，最終細胞能量耗竭，細胞死亡[1]。文獻報道早期給予PARP-1抑制劑可阻斷PARP-1酶活性，減輕缺血/再灌注中神經元的損傷[2]。因此本研究選取柴胡皂苷d和黃芩苷，通過建立大鼠腦缺血/再灌注損傷模型，檢測藥物對腦缺血/再灌注病灶中PARP-1及NAD+的表達情況，探討其在腦缺血/再灌注損傷中的神經保護機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組SD(Sprague-Dawley)大鼠420只，健康雄性，體質量(240±5)g，購自北京大學實驗動物科學部，隨機將大鼠分成正常組、假手術組、模型組、PARP-1抑制劑PJ34組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組7組，每組60只，按再灌注時間點不同分為6h、12h、24h、48h、72h五個亞組。

1.2藥物與試劑PARP-1抑制劑PJ34(美國Santa Cruz公司)；柴胡皂苷d(Sigma-Aldrich公司)；黃芩苷(Sigma-Aldrich公司)；栓線(北京沙東生物技術有限公司)，試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；NAD+濃度檢測酶循環(huán)法檢測試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；Trizol裂解液(Invitrogen 公司)；實時熒光定量PCR試(Fermentas公司)；PARP-1聚合體蛋白一抗(北京博奧森公司)。

1.3制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型大鼠稱重，腹腔注射麻醉7%水合氯醛(5mL·kg-1)，采用改進Longa線栓法，右側頸外動脈暴露并剪開，推栓線至大腦中動脈開口處，阻斷其血流，導致腦缺血，固定栓線，2h后拉出栓線，恢復血液供應，完成腦缺血再灌注損傷模型；假手術組不實施缺血再灌注只進行手術。

1.4用藥方法腦缺血/再灌注手術后2h 腹腔注射藥物：PJ34組(25mg·kg-1)、柴胡皂苷d組(70mg·kg-1)、黃芩苷組(30mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70mg·kg-1)+黃芩苷(30mg·kg-1)組；正常對照組、假手術組及模型組腹腔注射等量生理鹽水；各組均每天早晨給藥1次。

1.5神經功能損傷評分Longa評分標準于動物清醒后進行評分：0分：行為正常；1分：對側前爪伸展不充分，輕微不對稱；2分：行走時向外側轉圈；3分：行走時向對側傾斜，顫抖不穩(wěn)、跌倒；4分：不能行走，意識喪失；符合1-3分者大鼠納入實驗，其余剔除。

1.6修飾酶循環(huán)法檢測病灶中NAD+濃度將腦缺血/再灌注病灶組織分別置HEPES-NaOH液中研磨，將勻漿4℃15000r·rain-1離心20min，上清液即為組織總蛋白溶解液。組織總蛋白溶解液中NAD+濃度檢測按酶循環(huán)法檢測試劑盒內附說明書操作。

1.7定量RT-PCR方法檢測病灶中PARP-1 mRNA表達嚴格按照Trizol試劑盒說明書提取各組腦組織總RNA，測定總RNA量以及其純度，逆轉錄合成cDNA后，放置于-20℃?zhèn)錅y。PARP-1的上游引物5′-CCCAGGGTCTTCGGATAG-3′，下游引物5′-AGCGTGCTTCAGTTCATACA-3′，擴增片段長度為185bp；β-actin的上游引物5′-TCCGTGGAGAAGAGCTACGA-3′，下游引物5′-GTACTTGCGCTCAGAAGGAG-3′，擴增片段長度為309bp，以β-actin為內參對照。25μL反應體系為：SYBR Green Mix 12.5μL，上下游引物各1.0μL(5μmol/L)，ROX 0.5 μL，cDNA 1.0μL及9.0μL ddH2O；反應條件：95℃變性10min，然后按95℃×30s，55℃×1min，72℃×42s，進行40個循環(huán)，對結果進行分析。

1.8統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析釆用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2結果

2.1神經功能行為學評分與模型組相比，藥物干預組神經功能行為學評分有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)。見表1。

2.2腦組織NAD+濃度水平與正常組及假手術組相比，模型組NAD+濃度下降(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預組則濃度增加(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)。見表2。

表1　腦缺血/再灌注后不同時間神經功能行為學評分(n=6)

注：▲P< 0. 01，與假手術組和正常對照組比較；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，與模型組各對應時間點比較；◆P<0. 01，與PJ34組各對應時間點比較

表2　腦缺血/再灌注后不同時間腦組織的NAD+濃度(mg·g-1wet tissue，n=6)

注：▲P< 0. 01，與假手術組和正常對照組比較；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，與模型組各對應時間點比較；◆P<0. 01，與PJ34組各對應時間點比較

2.3PARP-1 mRNA的表達情況與正常組及假手術組相比，模型組PARP mRNA表達增加(P<0.01)；并隨缺血/再灌注時間延長呈動態(tài)變化，于24h時達最高峰，給予藥物干預后PARP mRNA表達降低，并于24h表達最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最為顯著(P<0.01)；而正常對照組和假手術組均無明顯變化。見表3。

表3　腦缺血/再灌注后不同時間腦組織的PARP-1 mRNA表達(%，n=6)

注：▲P< 0. 01，與假手術組和正常對照組比較；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，與模型組各對應時間點比較；◆P<0. 01，□P<0. 05，與PJ34組各對應時間點比較

3討論

PARP-1作為結合蛋白酶，其生物學效應包括識別及結合DNA缺口，修復損傷DNA，保證基因組完整性，進而催化多聚ADP核糖化，轉送NAD+核糖至受體蛋白，形成核糖鏈，通過改變受體蛋白結構，而影響受體蛋白生物學活性。目前有大量證據(jù)表明 PARP-1在腦缺血/再灌注損傷發(fā)展過程中起重要作用。Kauppinen等人[3]在大鼠雙側頸動脈結扎再灌注治療中發(fā)現(xiàn)，PARP-1抑制劑PJ34可抑制腫瘤壞死因子表達及小膠質細胞激活和星形膠質細胞增生，證實其可通過減少炎癥，增強缺血后神經元的存活和再生長期；短暫性大腦中動脈梗塞的動物模型(MCAO)中，PARP-1小鼠較野生型基因小鼠的梗塞面積明顯減小，將野生型PARP-1小鼠基因再轉移至PARP-1小鼠后其保護缺血/再灌注的作用消失[4]，證實梗塞面積的減小是因PARP-1基因缺陷所致，給予PARP-1抑制劑后梗塞面積亦減小，PARP-1缺陷在腦缺血/再灌注中的保護作用被多種酶抑制劑所重復，包括苯酰胺類、異喹啉酮化合物、phenanthridinones及多種經典PARP-1抑制劑[5]，充分證實PARP途徑在腦梗塞損傷中的病生理過程中的重要性，及PARP-1抑制劑的神經保護作用。

柴胡皂苷d是柴胡主要有效成分，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤，調解免疫及內分泌系統(tǒng)，抑制NF-κB、NF-AT激活的T淋巴細胞和AP-1信號對抗增殖作用[6]。黃芩的主要活性成分黃芩苷，具有抗凋亡、抗炎、免疫調節(jié)的作用[7]。

本研究結果表明大鼠短暫局灶性腦缺血/再灌注后缺血腦組織中PARP-1 mRNA表達明顯增加，NAD+過度消耗，而給予PARP-1抑制劑PJ34及柴胡皂苷d+黃芩苷干預后，PARP-1 mRNA表達明顯減少，二者統(tǒng)計學上無差異，證實柴胡皂苷d及黃芩苷同時給藥可減輕腦梗塞的缺血/再灌注損傷，其機制可能與其抑制PARP-1表達、NAD+消耗減少有關。為拓寬柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷在腦缺血/再灌注中的臨床應用提供了理論依據(jù)。

參考文獻

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[3]Kauppinen TM， Suh SW， Berman AE， et al. inhibition of poly(adp-ribose) polymerase suppresses inflammation and promotes recovery after ischemic injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab. 2009， 29(4)： 820-9.

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(收稿2016-01-08；修回2016-02-21)

通訊作者△

【中圖分類號】R743.31

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.082

*河北省衛(wèi)計委科研基金項目(ZL20140035)