楊秀芳，張影珍，馬養(yǎng)民

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安　710021)

?

貓兒屎內(nèi)生真菌DS58次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分的分離鑒定及活性研究

楊秀芳，張影珍，馬養(yǎng)民*

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安710021)

摘要：從貓兒屎內(nèi)生真菌黑曲霉DS58的發(fā)酵物中分離出6個化合物，通過化合物的理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)鑒定出這6個化合物分別為4-甲氧基-6-(3-甲基-丁?；?-吡喃-2-酮、campyrone A、3-羥基-3甲氧基羰基戊二酸、4-乙酰氨基丁酸、malformin A1和asperpyrones A，其中4-甲氧基-6-(3-甲基-丁?；?-吡喃-2-酮是首次被發(fā)現(xiàn)的新化合物，3-羥基-3甲氧基羰基戊二酸是首次從真菌發(fā)酵物中分離得到.并對分離獲得的化合物的抑菌活性、抗氧化活性進(jìn)行測試，結(jié)果表明：2,5-二羥基苯乙酸及其衍生物具有廣普的抑菌作用和良好的抗氧化活性，3-羥基-3甲氧基羰基戊二酸對番茄灰病菌和白菜黑斑病菌的MIC為31.5 μg/mL.

關(guān)鍵詞：貓兒屎；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物；化學(xué)成分；生物活性

0引言

貓兒屎(Decaisnea fargesii)，系木通科(Lardiyabalaeeae)，屬落葉灌木[1].貓兒屎的漿果形如縮小的香蕉，故又稱"野香蕉"，成熟后顏色由綠變成藍(lán)色或藍(lán)紫色，是亟待開發(fā)的野生植物資源之一，主要分布于甘肅、安徽、湖北、湖南、浙江、江西及西南等省區(qū)，陜西秦巴山區(qū)貓兒屎野生資源也極其豐富[2].其味辛、甘、性平，根及果實(shí)甘、涼[3]，據(jù)記載有解毒、殺菌、利尿、催生、鎮(zhèn)痛等功效，主治肺結(jié)核、咳嗽、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、陰癢和疝氣等癥[4].

目前對貓兒屎的研究僅限于該植物的化學(xué)成分，孔杰[5]從貓兒屎植物的莖中分離并鑒定了10個皂苷化合物.對貓兒屎內(nèi)生真菌的研究僅在本課題組開展，王鵬飛等[6]從秦嶺太白山貓兒屎的根、莖、葉中分離到內(nèi)生真菌91株，通過形態(tài)學(xué)鑒定這91株內(nèi)生真菌分屬于6目7科15屬，其中曲霉屬為優(yōu)勢種屬，通過活性測試，得到4株(DS37、DS58、DL06和DL14)強(qiáng)活性菌株.本研究以DS58為目標(biāo)菌株，對DS58菌株進(jìn)行ITS序列測定，最終將DS58菌株鑒定為黑曲霉(Aspergillus.niger),Genbank登錄號為KJ623700[7].本文在前報道[7]的基礎(chǔ)上，對貓兒屎內(nèi)生真菌DS58次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行了再研究，又分出6個化合物，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定.另外，對貓兒屎內(nèi)生真菌DS58分離獲得的14個化合物的活性進(jìn)行了分析測試.其研究結(jié)果將為貓兒屎內(nèi)生真菌資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1菌株

菌株DS58分離自秦嶺太白山貓兒屎植物的莖部，經(jīng)純化培養(yǎng)后以PDA斜面培養(yǎng)基4 ℃保存；4株活性測試細(xì)菌綠膿桿菌、乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌；4株植物病原真菌番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、煙草霜霉病菌、蘋果樹腐爛病菌.以上菌株均保存于課題組實(shí)驗(yàn)室.

1.2儀器、培養(yǎng)基和試劑

BrukeravanceIII-400MHz超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；EV311 型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(北京萊伯特科儀器有限公司)；柱層析硅膠( 200～300 目)和薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)；XT5型顯微熔點(diǎn)測定儀(北京市科儀電光儀器廠)；YX-2803型手提式蒸汽壓力滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)；ZHJH-C11098型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；HF2000型酶標(biāo)儀(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)；costar96孔酶標(biāo)板(3590)(美國CorningCostar公司).真菌培養(yǎng)基(馬玲薯浸出液200g，瓊脂20g，葡萄糖20g，蒸餾水1 000mL，pH7.0)；細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏0.5g，瓊脂2.0g，蛋白胨1.0g，NaCl0.5g，水100mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌20min).試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.3代謝產(chǎn)物的提取分離、鑒定

將風(fēng)干的固體發(fā)酵物用乙酸乙酯萃取6次，減壓濃縮得230.24g.采用硅膠柱色譜分離，以石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫，得到6個組分(Fr.1-Fr.6)，其中從Fr.1、Fr.2中依次得到化合物1～8，從Fr.3中得到化合物9、10，從Fr.4中得到化合物11，從Fr.5中得到化合物12，從Fr.6中得到化合物13和14.所有化合物經(jīng)1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS分析確定結(jié)構(gòu).

1.4抑菌活性測定

分別選取綠膿桿菌、乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蘋果腐爛病菌(C.m)、煙草赤星病菌(P.a)、番茄灰霉病菌(B.c)、白菜黑斑病菌(A.b)作為測試菌，采用最小抑菌濃度法對貓兒屎內(nèi)生真菌DS58次生代謝產(chǎn)物分離得到的化合物的抑菌活性進(jìn)行測試，具體操作方法見參考文獻(xiàn)[8].

1.5抗氧化活性測定

參照文獻(xiàn)[9]，采用96孔板，以Vc為對照品，對分離得到的具有酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行清除DPPH的抗氧化測試.重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計算樣品對DPPH自由基清除率.

2結(jié)果與分析

2.1菌株DS58代謝產(chǎn)物

從菌株DS58固體發(fā)酵物中共分離得到14個化合物，其中化合物1至8的結(jié)構(gòu)解析已作報道，見參考文獻(xiàn)[7]，下面就另6個化合物結(jié)構(gòu)解析如下.

化合物9：白色針狀晶體，易溶于氯仿.mp.101.8 ℃～102.4 ℃，分子式C11H14O4，HRESI-MSm/z, 233.079 2[M+Na]+(計算值為233.079 0).1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：6.78(1H，d，J=2.3Hz，H-5)，5.73(1H，d，J=2.1Hz，H-3)，3.87(3H，s，4-OCH3)，2.80(2H,d,J=6.8Hz，H-8)，2.22～2.28(1H，m，H-9)，0.91(6H，d,J=6.64Hz，H-10,11)；1C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)：193.47(C-7)，169.90(C-4)，162.42(C-2)，154.89(C-6)，103.72(C-5)，93.51(C-3)，56.39(4-OCH3)，46.80(C-8)，24.27(C-9)，22.52(C-10，C-11).對比相關(guān)文獻(xiàn)[10]，結(jié)合HMBC、DEPT-135 確定化合物9為4-甲氧基-6-(3-甲基-丁?；?-吡喃-2-酮，結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1　化合物9的結(jié)構(gòu)

化合物10：白色晶體(甲醇)，mp.147 ℃～148 ℃.1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：8.32(1H，d，J=8.6Hz，-NH)，6.10(1H，d,J=1.8Hz，H-5)，5.58(1H，d,J=1.8Hz，H-3)，4.39(1H，t，J=8.4Hz，H-7)，1.79(1H，m，H-8)，3.80(3H，s，CH3O-4)，1.44～1.22(2H，m，H-9)，1.87(3H，s，H-2)，0.83(3H，t，J=7.2Hz，H-10)，0.78(3H,d,J=6.4Hz，H-11)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)：170.69(C-4)，169.19(C-1′),163.82(C-2)，163.24(C-6)，99.99(C-5)，87.82(C-3)，56.37(4-OCH3)，54.91(C-7)，25.94(C-8)，24.53(C-9)，22.35(C-2′)，15.41(C-11)，10.78(C-10)，與文獻(xiàn)[11]對比，結(jié)合DEPT-135確定化合物10為campyroneA，結(jié)構(gòu)式如圖2所示.

圖2　化合物10的結(jié)構(gòu)

化合物11：白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp.163 ℃～165 ℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：12.29(2H，s，-COOH)，5.48(1H，s，-OH)，3.63(3H，s，-OCH3)，2.64～2.82(4H，AB峰，J=15.3Hz，-CH2)；13C-8NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm)： 73.37(-COOCH3)，171.05(-COOH)，72.87(C-3)，51.94(-OCH3)，42.92(-CH2).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]所報道的基本一致，確定化合物11為3-羥基-3甲氧基羰基戊二酸，結(jié)構(gòu)式如圖3所示.

圖3　化合物11的結(jié)構(gòu)

化合物12：無色晶體(甲醇)，mp：121 ℃～123 ℃.1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：12.05(1H，s，-COOH)，7.82(1H，s，-NH)，3.00～3.05(2H，m，H-4)，2.19～2.23(2H，t，J=7.2Hz，H-2)，1.57～1.64(2H，m，H-3)，1.79(3H，s，H-6)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：174.19(-COOH)，169.08(C-5)，37.85(C-4)，31.02(C-2)，24.55(C-3)，22.54(C-6).與文獻(xiàn)[13]的數(shù)據(jù)基本一致，結(jié)合DEPT-135，確定化合物12為4-乙酰氨基丁酸，結(jié)構(gòu)式如圖4所示.

圖4　化合物12的結(jié)構(gòu)

化合物13：白色絮狀物，難溶于甲醇.HRESI-MSm/z，552.228 6 [M+Na]+(計算值為552.229 0).1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：8.89(1H，d，J=3.84Hz，NH-18)，8.63(1H，d，J=6.76Hz，NH-12)，8.01(1H，d，J=8.76Hz，NH-1)，7.39(1H，d，J=9.12Hz，NH-6)，7.12(1H，d，J=11.0Hz，NH-21)，4.72(1H，ddd，J=15.28，10.92，4.56Hz，H-21)，4.47(1H，ddd，J=15.2，9.2，6.4Hz，H-6)，3.93(1H，s，H-1)，3.88(1H，dd，J=10.52，6.36Hz，H-12)，3.19(2H，m，19-a)，3.52(1H，19-b)，3.19(2H，m，22-a)，3.25(1H，22-b)，2.05(1H，m，H-2)，1.56(1H，m，H-8)，1.32(1H，m，7-a)，1.42(1H，m，7-b)，1.14(1H，m，14-a)，1.53(1H，m，14-b)，0.89(3H，d，J=6.6Hz，CH3-9)，0.87(3H，d，J=6.6Hz，CH3-10)，0.82～0.84(9H，疊加的d，J=6.84Hz，CH3-3，CH3-4，CH3-15)，0.79(3H，d，J=6.84Hz，CH3-16)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：173.96(20-CONH-)，172.99(11-CONH-)，172.75(17-CONH-)，170.52(5-CONH-)，169.68(23-CONH-)，58.76(C-1)，57.97(C-12)，52.84(C-21)，52.32(C-18)，50.27(C-6)，46.15(C-19)，45.15(C-22)，40.82(C-7)，33.93(C-13)，26.76(C-2)，24.69(C-14), 24.43(C-8), 22.67(C-9), 21.71(C-10)，19.65(C-3)，18.66(C-4), 14.88(C-16)，9.94(C-15).與文獻(xiàn)[14]的數(shù)據(jù)基本一致，結(jié)合DEPT-135和HSQC確定化合物13為malforminA1，結(jié)構(gòu)式如圖5所示.

圖5　化合物13的結(jié)構(gòu)

化合物14：黃綠色粉末狀，mp.223 ℃～224 ℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：15.12(1H，s，5′-OH)，12.92(1H，s，5-OH)，10.19(1H，s,8-OH)，6.15(1H，d，J=2.13Hz，9′-H)，6.57(1H，d，J=2.26Hz，7′-H)，7.09(1H，s，7-H)，6.99(1H，s，6-H)，6.53(1H，s，3-H)，6.22(1H，s，3′)，3.93(3H，s，6′-OCH3)，3.59(3H，s，8′-OCH3)，3.41(3H，s，10-OCH3)，2.48(3H，s，2-CH3)，2.15(3H，s，2′-CH3).13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：183.95(4′-CO-),182.35(4-CO-)，168.48 (C-2′)，167.96(C-2),162.06 (C-5′)，161.14(C-8′)，160.83 (C-6′),158.45(C-8),156.88(C-10),155.55(C-5),154.74(C-10b)，150.27(C-10a′)，140.15(C-6a)，140.07(C-9a′)，116.22(C-9)，110.02(C-3)，108.10(C-4a)，107.60(C-5a′)，106.57(C-10a，C-3′)，105.24(C-7)，105.18(C-10′)，104.44(C-6),103.33(C-4a′),96.89(C-9′),96.41(C-7′)，60.99(10-OCH3)，56.09(6′-OCH3)，55.06(8′-OCH3)，20.15(2′-CH3)，19.88(2-CH3)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15,16]，確定化合物14為asperpyronesA，結(jié)構(gòu)式如圖6所示.

圖6　化合物14的結(jié)構(gòu)

2.2化合物抑菌活性

從菌株DS58發(fā)酵物中分離得到的14個化合物抑菌活性測試結(jié)果見表1、表2所示.

表1化合物對細(xì)菌抑菌活性測試結(jié)果

化合物最小抑菌濃度MIC/(μg/mL)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌乳鏈球菌革蘭氏陰性菌大腸桿菌綠膿桿菌β-谷甾醇*(1)250>500250>5005α,8α-環(huán)二氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇*(2)>500>500>500>5005-羥基-2(3H)-苯并呋喃酮*(3)62.512562.562.52,5-二羥基苯乙酸乙酯*(4)62.512562.531.22,5-二羥基苯乙酸甲酯*(5)15.662.531.231.2琥珀酸*(6)>500>500>500>5002,5-二羥基苯乙酸*(7)62.562.5125125cannabifolactoneA*(8)12512562.562.54-甲氧基-6-(3-甲基-丁?；?-吡喃-2-酮(9)12512562.562.5campyroneA(10)>500>5002502503-羥基-3甲氧基羰基戊二酸(11)12525062.51254-乙酰氨基丁酸(12)12525012562.5malforminA(13)62.512562.562.5asperpyronesA(14)31.212562.5125硫酸鏈霉素7.87.8--青霉素鈉--1.951.95

注：“-”為未設(shè)置實(shí)驗(yàn) “*”為原來分離出的化合物，具體見參考文獻(xiàn)[7].

表2化合物對植物病原菌的抑菌活性測試結(jié)果

化合物最小抑菌濃度MIC/(μg/mL)B.cA.bP.aC.mβ-谷甾醇*(1)>500>500>500>5005α,8α-環(huán)二氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇*(2)>500>500>500>5005-羥基-2(3H)-苯并呋喃酮*(3)62.562.562.531.22,5-二羥基苯乙酸乙酯*(4)62.531.262.531.22,5-二羥基苯乙酸甲酯*(5)62.531.231.231.2琥珀酸*(6)>500>500>500>5002,5-二羥基苯乙酸*(7)62.531.262.5125cannabifolactoneA*(8)12562.562.51254-甲氧基-6-(3-甲基-丁?；?-吡喃-2-酮(9)12562.562.562.5campyroneA(10)>500>500>500>5003-羥基-3甲氧基羰基戊二酸(11)31.231.262.562.54-乙酰氨基丁酸(12)>500>500>500>500malforminA(13)62.5125125125asperpyronesA(14)125125250250酮康唑7.817.8115.631.2

由表2可知，化合物3、4、5、7、8、9、11、13、14對4株細(xì)菌和4株真菌表現(xiàn)出不同的抑制作用，其中化合物3、4、7、9對細(xì)菌和真菌有良好的抑制作用，化合物5的抑菌效果最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的MIC為15.6 μg/mL，化合物11表現(xiàn)出良好的抗真菌能力，對番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌MIC為31.2 μg/mL.

2.3化合物抗氧化活性

對分離得到的具有酚羥基化合物3、4、5、7、8、14進(jìn)行抗氧化活性測試，結(jié)果如表3所示.其中化合物3的抗氧化活性最好(IC50=4.124 μg/mL)，且它的同系物抗氧化能力均與Vc相當(dāng).

表3　自由基清除率測試結(jié)果

3結(jié)論

(1)從貓兒屎內(nèi)生真菌黑曲霉DS58的固體發(fā)酵物中又分離得到了6個化合物，其中4-甲氧基-6-(3-甲基-丁酰基)-吡喃-2-酮是新化合物，3-羥基-3甲氧基羰基戊二酸是首次從真菌代謝物中得到.結(jié)合文獻(xiàn)[7]可知，株菌DS58可產(chǎn)生2,5-二羥基苯乙酸及其衍生物.

(2)化合物的生物活性(抑菌活性和抗氧化活性)顯示菌株DS58產(chǎn)生的2,5-二羥基苯乙酸及其衍生物具有廣普的抑菌效果和良好的抗氧化活性.

參考文獻(xiàn)

[1] 應(yīng)俊生,陳德昭.中國植物志[M].北京：北京科學(xué)出版社,2001.

[2] 孫翔宇,高貴田,嚴(yán)勃,等.三葉木通與貓兒屎種子脂肪酸和氨基酸分析[J].中藥材,2012,35(9):1 444-1 447.

[3] 白成科.貓兒屎和三葉木通種子油中脂肪酸成分的GC-MS分析[J].西北植物學(xué)報,2007,27(5)：859-863.

[4] 云南省植物研究所.云南植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1979.

[5] 孔杰.貓兒屎植物的化學(xué)成分及其藥效學(xué)研究[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1996,32(3):108-111.

[6] 王鵬飛,馬養(yǎng)民,孔陽.貓兒屎內(nèi)生真菌分離鑒定及抑菌活性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科技,2013,40(13):85-88.

[7] 張影珍,馬養(yǎng)民,王鵬飛.貓兒屎內(nèi)生真菌DS58次生代謝產(chǎn)物的研究[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2015,15(3):183-185.

[8] 楊秀芳,馬養(yǎng)民,王改利,等.水楊梅中化學(xué)成分活性的研究[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,32(1):123-127.

[9] 孫麗萍,穆雪峰,施海燕,等.北京洋槐蜜化學(xué)成分及其抗氧化活性[J].食品科學(xué),2012,33(9):77-90.

[10]EvidenteA,ZonnoMC,AndolfiA,etal.Phytotoxica-pyronesproducedbypestalotiopsisguepinii,thecausalagentofhazelnuttwigblight[J].TheJournalofAntibiotics,2012,65(4):203-206.

[11]FerdinandMT,MichelKT,HartmutL,etal.Structuresandabsoluteconfigurationofthreeα-pyronesfromanendophyticfungusaspergillusniger[J].Tetrahedron,2013,69:7 147-7 151.

[12] 徐治國,黃松，杜方麓,等.碩苞薔薇果化學(xué)成分研究(II)[J].中藥材,2003,26(12):867-869.

[13] 劉凈,謝濤,魏秀麗.冬凌草化學(xué)成分的研究[J].中國天然產(chǎn)物,2004,5(2):276-279.

[14] 王發(fā)左,朱天驕,張敏,等.海洋真菌Rhizopussp.2-PDA-61化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2011,23(2):199-201.

[15]ZhanJX,KamalGM,GunatilakaAL,etal.AsperpyroneDandothermetabolitesoftheplant-associatedfungalstrainaspergillustubingensis[J].Phytochemistry,2007,68:368-372.

[16]KohkiA,SeigoT,YukikoH,etal.Newdimericnaphthopyronesfromaspergillusniger[J].JournalofNaturalProducts,2003,66:136-139.

【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

AntimicrobialactivityandisolationandidentifitionofthesecondarymetabolitesfromendophyticfungiDS58ofDecaisnea fargesii

YANGXiu-fang，ZHANGYing-zhen,MAYang-min*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,KeyLaboratoryofAuxiliaryChemistry&TechnologyforChemicalIndustry,MinistryofEducation,ShaanxiUniversityofScience&Technology,Xi′an710021，China)

Abstract:Six known compounds had been isolated from the Aspergillus.niger DS58 of Decaisnea fargesii.Their structures were identified by physicochemical properties and spectra analysis.Six compounds were obtained and identified as 4-methoxy-6-(3-methyl-butyryl)-pran-2-one,campyrone A,3-hydroxy-3-(methoxycarbonyl) pentanedioic acid,4-acetamidobutanoic acid,malformin A1 and asperpyrones A.4-methoxy-6-(3-methyl-butyryl)-pran-2-one is a new one which was isolated from the natural. 3-hydroxy-3-(methoxycarbonyl) pentanedioic acid was isolated from the culture of the fungi for the first time.Compounds′ antibacterial activity and antioxidant activity test showed that the 2,5-dihydroxy benzeneacetic acid and its derivatives are widely bacteriostasis and good antioxidant activity,3-hydroxy-3-(methoxycarbonyl) pentanedioic acid has an effectively inhibit in plant pathogenic fungi.The MIC of Botrytis cinerea and Alternaria brassicae (Berk.) is 31.5 μg/mL.

Key words:Decaisnea fargesii；endophytic fungi；metabolites；chemical constituents；bioactivities

*收稿日期:2016-02-11

基金項目：陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2014JZ003)

作者簡介:楊秀芳(1963-)，女，陜西銅川人,教授，研究方向:天然產(chǎn)物的提取及開發(fā) 通訊作者:馬養(yǎng)民(1963-)，男，陜西乾縣人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物,mayangmin@sust.edu.cn

文章編號：1000-5811(2016)04-0145-05

中圖分類號：TQ041+.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A