喬麟軼常建忠郭慧娟高建剛鄭 軍暢志堅(jiān)，*1山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 00006；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原0001；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾 01000；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原0001；北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心，北京 100097

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小麥全基因組NBS類R基因分析及2AL染色體NBS-SSR特異標(biāo)記開發(fā)

喬麟軼1，2常建忠4郭慧娟2高建剛5鄭 軍3，*暢志堅(jiān)1，2，*1山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；3山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾 041000；4山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；5北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心，北京 100097

摘 要：NBS （nucleotide binding site）類基因是植物界中最重要的一類抗病基因。用信息學(xué)方法從普通小麥（Triticum aestivum L.）全基因組中分離出2406條含有NBS結(jié)構(gòu)的完整蛋白序列，每條包含48～2272個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)NBS結(jié)構(gòu)域兩端是否連接CC或LRR結(jié)構(gòu)域，將TaNBS分為N、CN、NL和CNL 4類。對(duì)TaNBS所在scaffold序列的SSR位點(diǎn)進(jìn)行診斷，從1203條scaffold序列上發(fā)現(xiàn)2177個(gè)SSR位點(diǎn)，以二堿基重復(fù)位點(diǎn)最多，占73.5%。針對(duì)小麥2AL染色體上的51個(gè)SSR位點(diǎn)開發(fā)標(biāo)記，缺體-四體和雙端體驗(yàn)證結(jié)果表明，有39個(gè)標(biāo)記（76.5%）為2AL特異標(biāo)記，其中24個(gè)特異標(biāo)記在抗白粉病材料Khapli （2AL上攜帶Pm4a）和感病材料Chancellor間存在多態(tài)性。利用近等基因系Khapli/8*Cc篩選出3個(gè)可能與Pm4a連鎖的NBS-SSR標(biāo)記，分別是Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39和Sxaas_2AL46。本研究開發(fā)的與抗病序列緊密連鎖的特異SSR標(biāo)記可用于2AL染色體上抗病新基因的檢測(cè)以及已有抗病基因的候選序列篩選。

關(guān)鍵詞：小麥；抗??；NBS類基因；SSR標(biāo)記；2AL染色體

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171839，31401385），山西省青年基金項(xiàng)目（2015021145），山西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（20150311001-1，20150311001-5），山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項(xiàng)目（15YGG01）和北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（QNJJ201428）資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31171839，31401385），Shanxi Province Science Foundation for Youths （2015021145），Shanxi Province Technologies R&D Program （20150311001-1，20150311001-5），the Technologies R&D Program of the Shanxi Academy of Agricultural Sciences （15YGG01），and the Youth Foundation of Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences （QNJJ201428）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ qiaoly1988@126.com

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160321.1056.002.html

小麥?zhǔn)鞘澜绲闹饕诩Z作物之一，是世界第二大糧食作物。近40年來，由于白粉病、銹病等病害的大面積流行，小麥生產(chǎn)不斷遭到嚴(yán)重威脅。以白粉病為例，由于小麥種植密度加大、水肥條件改善和品種抗源單一等原因，小麥白粉病從我國(guó)西南和東南沿海局部地區(qū)迅速蔓延至全國(guó)所有麥區(qū)，發(fā)病面積從1980年的100萬公頃擴(kuò)展到2015年的570萬公頃（http∶//cb.natesc.gov.cn/）。1990年和 1991年全國(guó)白粉病大爆發(fā)分別造成當(dāng)年1.44億千克和0.77億千克小麥產(chǎn)量的損失［1］。抗病品種是有效控制小麥主要病害的最經(jīng)濟(jì)和有效的方法［2］，也是小麥育種的重要目標(biāo)。但是，隨著病原菌的變異和新類型不斷產(chǎn)生，原有抗病品種逐漸喪失抗性，使小麥生產(chǎn)面臨新的挑戰(zhàn)。因此，廣泛挖掘抗病基因是一項(xiàng)持續(xù)而緊迫的工作，是選育小麥抗病品種的重要前提。

分子標(biāo)記選擇技術(shù)極大地促進(jìn)了抗病基因的鑒定，尤其是簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記，因其大量分布于基因島和重組熱點(diǎn)區(qū)域，且變異常與臨近基因的交換重組密切相關(guān)［3］，從而被廣泛應(yīng)用于小麥抗病基因的定位。目前，正式命名并定位到小麥分子圖譜上的抗病基因包括54個(gè)抗白粉病基因、74個(gè)抗條銹病基因、73個(gè)抗葉銹病基因和57個(gè)抗稈銹病基因，其中有13個(gè)基因被成功克?。?-14］。在已克隆基因中，Pm3b［4］、Pm3c［5］、Pm3f［6］、Pm3g［5］、Yr10［7］、Lr1［8］、Lr10［9］、Lr21［10］、Sr33［11］、Sr35［12］10個(gè)基因均為NBS類抗病基因。NBS基因是植物界最重要、家族成員最多的一類抗病基因，其編碼的NBS結(jié)構(gòu)域包含 Kinase1、Kinase2、Kinase3、HD殘基等保守基序［15］，可通過結(jié)合ATP或GTP來直接或間接引導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生識(shí)別病原體效應(yīng)，并參與抗病信號(hào)的傳導(dǎo)過程［16］。在單子葉植物中，一些NBS結(jié)構(gòu)域的N端有時(shí)連接有一個(gè)與蛋白互作有關(guān)的CC （coiled-coil）結(jié)構(gòu)，而 C端通常連接有一個(gè)與病原菌識(shí)別相關(guān)的LRR （leucine-rich repeat）結(jié)構(gòu)域［17］。

史靜東等［18］曾利用巢式PCR技術(shù)獲得4個(gè)小麥NBS類抗病基因片段，并通過群體檢測(cè)，證實(shí)其中一個(gè)片段與Yr26共分離。隨著小麥測(cè)序草圖的公布，在全基因組范圍內(nèi)對(duì)小麥NBS基因家族的研究成為可能。Bouktila等［19］利用普通小麥品種中國(guó)春的454測(cè)序數(shù)據(jù)［20］，分離了包含NBS結(jié)構(gòu)的小麥序列，然而這些序列在染色體上的具體位置尚不得知。本研究利用基于染色體臂分離測(cè)序技術(shù)的小麥基因組數(shù)據(jù)［21］，從全基因組范圍內(nèi)分離了小麥NBS序列，診斷了序列鄰近的SSR位點(diǎn)，并在2AL染色體上針對(duì)NBS-SSR位點(diǎn)開發(fā)分子標(biāo)記，篩選出染色體臂特異標(biāo)記，同時(shí)利用小麥抗、感材料，對(duì)新開發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行了多態(tài)性分析和抗病基因連鎖性檢測(cè)。本研究結(jié)果豐富了小麥抗病基因的分子標(biāo)記，可用于抗病基因的標(biāo)記輔助檢測(cè)以及候選序列篩選。

1 材料與方法

1.1 植物材料

小麥品種Khapli （2AL染色體上攜帶Pm4a）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所賈繼增研究員惠贈(zèng)，Pm4a的近等基因系 Khapli/8*Cc及其輪回親本Chancellor （Cc）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周益林研究員惠贈(zèng)。用于分子標(biāo)記檢測(cè)的中國(guó)春缺體-四體材料和雙端體材料由美國(guó)農(nóng)業(yè)部種質(zhì)研究中心惠贈(zèng)。

1.2 家族蛋白序列的分離

從URGI數(shù)據(jù)庫（http∶//wheat-urgi.versailles.inra. fr/）下載小麥全基因組數(shù)據(jù)建立 BLAST蛋白數(shù)據(jù)庫和核酸數(shù)據(jù)庫。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http∶//pfam.sanger.ac. uk/）中下載NBS家族（Pfam登錄號(hào)為PF00931）的隱馬爾可夫模型文件，用HMM 3.0軟件檢索本地蛋白數(shù)據(jù)庫得到目標(biāo)氨基酸序列，設(shè)置E≤1e-5。

1.3 結(jié)構(gòu)域分析和蛋白序列特征分析

利用SMART服務(wù)器（http∶//smart.embl-hei-delberg. de/）對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行 NBS蛋白保守結(jié)構(gòu)域的檢查，參數(shù)為默認(rèn)值。篩選得到的序列遞交NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd），進(jìn)一步分析與NBS關(guān)聯(lián)的CC、LRR等其他結(jié)構(gòu)域的特征。

用DNAstar軟件中的Editseq工具獲得TaNBS蛋白的長(zhǎng)度信息。用Clustal X軟件進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)，參數(shù)為默認(rèn)值，用Jalview輸出比對(duì)結(jié)果。

1.4 染色體定位

利用小麥NBS蛋白序列編號(hào)在本地核酸數(shù)據(jù)庫中提取相應(yīng)的CDS序列和基因組（scaffold）序列。將scaffold序列返回本地核酸數(shù)據(jù)庫檢索，獲得其在小麥基因組中的位置信息，從而將 TaNBS排列到染色體上。

1.5 NBS-SSR位點(diǎn)診斷和引物設(shè)計(jì)

利用SSRhurnter軟件查找TaNBS所在scaffold序列的SSR位點(diǎn)。設(shè)定每重復(fù)單元堿基數(shù)為2～5，重復(fù)次數(shù)≥5。利用Primer5軟件對(duì)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1 24對(duì)多態(tài)性的小麥2AL染色體特異標(biāo)記Table 1 Twenty-four polymorphic markers specific to wheat chromosome 2AL

1.6 DNA提取和SSR標(biāo)記檢測(cè)

采用SDS法提取基因組總DNA。PCR總體系為15 μL，含1.5 μL 10× buffer （TaKaRa）、0.2 mmol L-1dNTP、1 U Taq酶（TaKaRa）、0.25 μmol L-1引物和100 ng模板DNA。反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性5 min；94℃變性45 s，58℃復(fù)性45 s，72℃延伸 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr與 Bis質(zhì)量比為 29∶1）電泳，硝酸銀染色后觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 NBS家族基因的染色體分布和結(jié)構(gòu)分類

利用NBS隱馬模型文件在小麥本地蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，并檢測(cè)檢索結(jié)果，獲得2406條含有NBS結(jié)構(gòu)的完整蛋白序列，分布于小麥基因組21條染色體上，以 B基因組比率最高（37.4%），其次是 A基因組（34.3%），而D基因組最低（28.3%）；從單個(gè)染色體看，在4A染色體上分布最多，達(dá)248條，而在4D染色體上分布最少，僅24條（圖1）。

圖1 小麥NBS序列的染色體分布Fig. 1 Distribution of NBS sequences on chromosomes in wheat

分離出的TaNBS序列長(zhǎng)度差異較大，最短的序列Ta1asLoc007418只有48個(gè)氨基酸殘基，最長(zhǎng)的為Ta7blLoc002272，有2272個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)是否包含CC和LRR結(jié)構(gòu)域，將2406個(gè)TaNBS序列分為4類，分別是CC-NBS-LRR、NBS-LRR、CC-NBS 和NBS，其中只具有NBS結(jié)構(gòu)的TaNBS最多，有1209條，占總數(shù)的50.2% （圖2）。

圖2 小麥TaNBS序列的結(jié)構(gòu)分類Fig. 2 Structural classification of TaNBS protein sequences

2.2 小麥NBS-SSR位點(diǎn)診斷

從本地核酸數(shù)據(jù)庫中提取TaNBS的CDS序列和基因組（scaffold）序列，查找所在 scaffold序列的SSR位點(diǎn)，在其中的1203條scaffold序列上共檢測(cè)到2177個(gè)SSR位點(diǎn)，A、B、D基因組分別占33%、40%和27% （圖3-a）。其中二堿基重復(fù)位點(diǎn)最多，占73.5%；五堿基重復(fù)位點(diǎn)最少，僅0.3% （圖3-b）。

2.3 2AL染色體上TaNBS序列特征分析

將位于2AL上的56個(gè)TaNBS蛋白序列多重比對(duì)的結(jié)果顯示，一些TaNBS序列與已克隆抗白粉病基因的NBS結(jié)構(gòu)域有高度相似的基序（圖4），如用于結(jié)合 ATP/GTP的磷酸結(jié)合環(huán)P-loop （GGV/LGKTT），以及Kinase2 （VLDDVW）、Kinase3 （GSxxLA/VTTR）和末端HD殘基。推測(cè)這些TaNBS蛋白也可能具有類似的抗病作用。2.4 2AL染色體NBS-SSR標(biāo)記開發(fā)及檢測(cè)

圖3 小麥全基因組NBS-SSR位點(diǎn)診斷Fig. 3 Genome-wide diagnosis of NBS-related SSR loci in wheat

在小麥2AL染色體上56個(gè)TaNBS所在的基因組序列片段中，共有25個(gè)scaffold存在NBS-SSR位點(diǎn)，通過比對(duì) 2AL基因組數(shù)據(jù)獲得的位置信息，將這25個(gè)scaffold在2AL染色體臂上線性排列（表2）。在這些基因組片段中共檢測(cè)到52個(gè)SSR位點(diǎn)，除了位于 Sca1697100起始端口的重復(fù)位點(diǎn)（TG）5以外，對(duì)其余51個(gè)SSR位點(diǎn)的側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)引物，依次命名為Sxaas_2AL01～Sxaas_2AL51。

對(duì)51個(gè)2AL-NBS-SSR標(biāo)記進(jìn)行特異性篩選，有39個(gè)標(biāo)記在缺體-四體N2BT2A、N2BT2D、N2DT2A、N2DT2B和中國(guó)春中均擴(kuò)增出目標(biāo)帶，而在N2AT2B、N2AT2D和雙端體 Dt2AS中沒有目標(biāo)帶，表明這些NBS-SSR標(biāo)記為2A染色體長(zhǎng)臂特異標(biāo)記。

利用抗病品種Khapli及其 Pm4a-NIL群體、感病輪回親本 Chancellor，對(duì)39個(gè)2AL-NBS-SSR特異標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，24個(gè)標(biāo)記（表1）在 Khapli和Chancellor中的擴(kuò)增產(chǎn)物存在差異，表明這些特異標(biāo)記在抗、感材料間具有較好的多態(tài)性，其中Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39和 Sxaas_2AL46在Pm4a-NILs中的擴(kuò)增條帶與Khapli中的一致，表明這3個(gè)標(biāo)記很可能與Pm4a連鎖（圖5）。

圖4 小麥2AL上部分TaNBS結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì)Fig. 4 Multiple alignment of some TaNBS sequences on chromosome 2AL

表2 小麥2AL染色體上52個(gè)NBS-SSR位點(diǎn)Table 2 Fifty-two NBS-SSR loci on chromosome 2AL of wheat

圖5 Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39和Sxaas_2AL46的特異性及與Pm4a的連鎖性檢測(cè)Fig. 5 Detection of chromosome specificity and the genetic

3 討論

3.1 小麥NBS家族概況

NBS類基因在苔蘚植物、石松植物、裸子植物和被子植物中均有相關(guān)研究報(bào)道［17］，是植物中數(shù)量最多的抗病基因家族。而小麥作為世界上最重要、種植最廣的農(nóng)作物，常年遭受白粉菌、條銹菌、葉銹菌、稈銹菌及赤霉菌等病原菌的侵染，深入研究小麥NBS類基因?qū)τ跍p少小麥產(chǎn)量損失顯得尤為重要。

本研究從小麥基因組中分離出2406個(gè)完整TaNBS序列，數(shù)目遠(yuǎn)高于粳稻的 653個(gè)［22］、秈稻的553個(gè)［22］、大豆的319個(gè)［23］、高粱的211個(gè)［24］以及玉米的109個(gè)［25］。我們還分別從烏拉爾圖小麥和粗山羊草的基因組中分離出681條和946條NBS序列（結(jié)果未列出），由此初步推測(cè)，普通小麥TaNBS家族是由其3個(gè)亞基因組供體物種的NBS家族通過兩次多倍體化事件整合而來。此外，在TaNBS中還存在多個(gè)NBS基因位于一個(gè)scaffold上的現(xiàn)象，僅2AL染色體上就有8個(gè)這樣的基因簇（部分見表2），推斷TaNBS家族可能還經(jīng)歷了串聯(lián)重復(fù)事件，最終造成小麥基因組中NBS龐大的成員數(shù)目。然而同一同源群中各染色體上的NBS數(shù)目并不相近，如4A染色體上有248個(gè)TaNBS基因，而4B和4D上分別只具有 40個(gè)和 24個(gè)，這可能由于六倍體小麥基因組復(fù)制而造成大量基因的功能冗余，因此冗余的部分TaNBS基因?qū)?huì)變成假基因或者逐漸丟失，最終形成各基因組間基因數(shù)目的不同現(xiàn)象。

TaNBS蛋白包含NBS的4個(gè)特征基序，根據(jù)兩端是否連接CC或LRR結(jié)構(gòu)域，可將其分為N、CN、NL和CNL四類，已克隆的10個(gè)小麥NBS類抗病基因均為CNL結(jié)構(gòu)［4-12］。一些TaNBS還包含其他類型的結(jié)構(gòu)域，如 Ta1blLoc007763、Ta2bsLoc001037 和 Ta3alLoc007069等包含 STK （serine/threonine kinase）結(jié)構(gòu)；Ta2bsLoc003709和Ta2bsLoc014737等包含 ABC （ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)；Ta2alLoc020734、Ta2dlLoc021209和Ta6bsLoc009346等包含Jacalin結(jié)構(gòu)；Ta2alLoc012596、Ta2blLoc002392、Ta5dlLoc013799和 Ta5dlLoc017355等包含鋅指結(jié)構(gòu)。其中 STK結(jié)構(gòu)域和 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域分別是Pm21和Lr34的功能域［13-14］，Jacalin結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域也被證實(shí)與小麥抗病性有關(guān)［26-27］。這些結(jié)構(gòu)域通常與NBS結(jié)構(gòu)域互相作用，共同抵抗病原菌的入侵。類似研究已有報(bào)道，如擬南芥中 RRS1蛋白的NBS域C端連接一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，該WRKY結(jié)構(gòu)域在擬南芥對(duì)青枯菌的響應(yīng)通路中起抑制作用，與NBS結(jié)構(gòu)域一起形成獨(dú)特的抗病機(jī)制［28］。因此下一步有必要對(duì)這些包含其他類型結(jié)構(gòu)域的TaNBS深入研究。

3.2 NBS-SSR特異標(biāo)記在基因定位及分子育種中的應(yīng)用價(jià)值

廣泛發(fā)掘、鑒定抗病基因是小麥抗病育種的基礎(chǔ)，在抗病基因定位過程中應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記是SSR標(biāo)記。然而普通小麥包含A、B、D 3個(gè)基因組和高比例的重復(fù)序列（80%）［21］，常規(guī)SSR標(biāo)記在小麥染色體間存在多位點(diǎn)現(xiàn)象，很可能造成定位結(jié)果的偏差。本研究以小麥 2A染色體長(zhǎng)臂為例，對(duì)TaNBS基因所在scaffold上的51個(gè)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，通過缺體四體和雙端體材料篩選，有 39個(gè)（76.5%） SSR標(biāo)記具有染色體特異性，且具有良好的多態(tài)性。目前我們正在用作圖群體將這些NBS-SSR特異標(biāo)記定位到小麥遺傳圖譜，而小麥2AL上存在抗白粉病基因Pm4a［29］、Pm4b［30］、Pm4c［31］、Pm4d［32］、Pm50［33］，抗條銹病基因Yr1［34］、Yr32［35］，抗葉銹病基因Lr38［36］和抗稈銹病基因Sr21［37］等多個(gè)抗病基因位點(diǎn)，其中Sr21所在區(qū)段更是與短柄草和水稻染色體上的 NBS基因簇同源［37］，因此 2AL-NBS-SSR特異標(biāo)記的開發(fā)對(duì)上述基因的精細(xì)定位以至克隆有重要的參考價(jià)值。另外本研究從小麥全基因組中共診斷出2177個(gè) NBS-SSR位點(diǎn)，通過特異性篩選和群體遺傳定位，預(yù)計(jì)可開發(fā)出1000余對(duì)位置明確、染色體特異的NBS-SSR標(biāo)記，這將顯著減少小麥抗病基因定位過程中存在的誤差。

目前，在小麥中被正式命名的各類抗病基因?qū)⒔?300個(gè)左右，其中只有少數(shù)幾個(gè)被用于生產(chǎn)，大部分抗病基因在未用于育種之前就有可能因病原菌變異而面臨失去抗性的危險(xiǎn)。真正利用分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）育出的小麥抗病品種鮮有報(bào)道，一個(gè)很重要原因就是分子標(biāo)記與目標(biāo)基因距離較遠(yuǎn)，造成MAS過程中分子標(biāo)記與目標(biāo)基因重組，導(dǎo)致標(biāo)記跟蹤信息丟失。雖然基于小麥基因組測(cè)序數(shù)據(jù)已開發(fā)出高密度、高精度的SNP芯片，但費(fèi)用較高，暫時(shí)不適合用于育種過程中的大群體篩選。本研究從提高常規(guī)分子標(biāo)記的精準(zhǔn)度入手，開發(fā)的每個(gè)SSR標(biāo)記均與小麥NBS序列位于同一條 scaffold序列上，當(dāng)某個(gè) TaNBS被確定與抗病性相關(guān)時(shí)，其最近的NBS-SSR標(biāo)記與之緊密連鎖，幾乎不發(fā)生重組，可以作為共分離標(biāo)記使用，將提高育種過程中MAS的效率。

4 結(jié)論

從普通小麥基因組中分離出分布于各染色體的2406條含有NBS結(jié)構(gòu)的完整蛋白序列，按結(jié)構(gòu)分為N、CN、NL和CNL共4類，每條序列包含48～2272個(gè)氨基酸殘基。在TaNBS所在基因組序列中的1203 條scaffold序列上診斷出2177個(gè)SSR位點(diǎn)，其中二堿基重復(fù)位點(diǎn)占73.5%。針對(duì)小麥2AL染色體上的51個(gè)NBS-SSR位點(diǎn)開發(fā)標(biāo)記，篩選出39個(gè)2AL染色體特異標(biāo)記，包括24個(gè)在抗白粉病材料Khapli和感病材料 Chancellor間存在多態(tài)性，其中 Sxaas_ 2AL22、Sxaas_2AL39和Sxaas_2AL46可能與Pm4a連鎖。

致謝： 北京安貞醫(yī)院/北京市心肺血管疾病研究所李小燕博士在信息學(xué)分析中給予了寶貴指導(dǎo)，謹(jǐn)致謝忱。

References

［1］ Li H J，Wang X M. Thinopyrum ponticum and Th. intermedium∶the promising source of resistance to fungal and viral diseases of wheat. J Genet Genomics，2009，36∶ 557-565

［2］ Line R F，Chen X M. Success in breeding for and managing durable resistance to wheat rusts. Plant Dis，1995，79∶ 1254?1255

［3］ Ott A，Trautschold B，Sandhu D. Using microsatellites to understand the physical distribution of recombination on soybean chromosomes. PLoS One，2011，6∶ e22306

［4］ Yahiaoui N，Srichumpa P，Dudler R，Keller B. Genome analysis at different ploidy levels allows cloning of the powdery mildew resistance gene Pm3b from hexaploid wheat. Plant J，2004，37∶528-538

［5］ Tommasini L，Yahiaoui N，Srichumpa P，Keller B. Development of functional markers specific for seven Pm3 resistance alleles and their validation in the bread wheat gene pool. Theor Appl Genet，2006，114∶ 165-175

［6］ Srichumpa P，Brunner S，Keller B，Yahiaoui N. Allelic series of four powdery mildew resistance genes at the Pm3 locus in hexaploid bread wheat. Plant Physiol，2005，139∶ 885-895

［7］ Liu W，F(xiàn)rick M，Huel R，Nykiforuk C L，Wang X，Gaudet D A，Eudes F，Conner R L，Kuzyk A，Chen Q，Kang Z，Laroche A. The stripe rust resistance gene Yr10 encodes an evolutionaryconserved and unique CC-NBS-LRR sequence in wheat. Mol Plant，2014，7∶ 1740-1755

［8］ Cloutier S，McCallum B D，Loutre C，Banks T W，Wicker T，F(xiàn)euillet C，Keller B，Jordan M C. Leaf rust resistance gene Lr1，isolated from bread wheat （Triticum aestivum L.） is a member of the large psr567 gene family. Plant Mol Biol，2007，65∶ 93-106

［9］ Sela H，Spiridon L N，Petrescu A J，Akerman M，Mandel-Gutfreund Y，Nevo E，Loutre C，Keller B，Schulman A H，F(xiàn)ahima T. Ancient diversity of splicing motifs and protein surfaces in the wild emmer wheat （Triticum dicoccoides） LR10 coiled coil （CC）and leucine-rich repeat （LRR） domains. Mol Plant Pathol，2012，13∶ 276-287

［10］ Huang L，Brooks S A，Li W，F(xiàn)ellers J P，Trick H N，Gill B S. Map-based cloning of leaf rust resistance gene Lr21 from the large and polyploid genome of bread wheat. Genetics，2003，164∶655-664

［11］ Periyannan S，Moore J，Ayliffe M，Bansal U，Wang X，Huang L，Deal K，Luo M，Kong X，Bariana H，Mago R，McIntosh R，Dodds P，Dvorak J，Lagudah E. The gene Sr33，an ortholog of barley Mla genes，encodes resistance to wheat stem rust race Ug99. Science，2013，341∶ 786-788

［12］ Saintenac C，Zhang W，Salcedo A，Rouse M N，Trick H N，Akhunov E，Dubcovsky J. Identification of wheat gene Sr35 that confers resistance to Ug99 stem rust race group. Science，2013，341∶ 783-786

［13］ Cao A，Xing L，Wang X，Yang X，Wang W，Sun Y，Qian C，Ni J，Chen Y，Liu D，Wang X，Chen P. Serine/threonine kinase gene Stpk-V，a key member of powdery mildew resistance gene Pm21，confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108∶ 7727-7732

［14］ Krattinger S G，Lagudah E S，Spielmeyer W，Singh R P，Espino J H，McFadden H，Bossolini E，Selter L L，Keller B. A putative ABC transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens in wheat. Science，2009，323∶ 1360-1363

［15］ Meyers B C，Kozik A，Griego A，Kuang H，Michelmore R W. Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in Arabidopsis. Plant Cell，2003，15∶ 809-834

［16］ Bourne H R，Sanders D，McCormick F. The GTPase superfamily∶conserved structure and molecular mechanism. Nature，1991，349∶117-127

［17］ Belkhadir Y，Subramaniam R，Dangl J L. Plant disease resistance protein signaling∶ NBS-LRR proteins and their partners. Curr Opin Plant Biol，2004，7∶ 391-399

［18］ 史靜東，張小娟，黃麗麗，韓德俊，康振生. 小麥 NBS-LRR類抗病基因類似片段分離和定位. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46∶2022-2031 Shi J D，Zhang X J，Huang L L，Han D J，Kang Z S. Isolation and mapping of NBS-LRR resistance gene homology sequences from wheat. Sci Agric Sin，2013，46∶ 2022-2031 （in Chinese with English abstract）

［19］ Rachel B，Manuel S，Matthias P，Gary L A B，Rosalinda D A，Alexandra M A，Neil M，Melissa K，Arnaud K，Dan B，Suzanne K，Darren W，Martin T，Ian B，Gu Y，Huo N X，Luo M C，Sunish S，Bikram G，Sharyar K，Olin A，Paul K，Jan D，Richard M，Anthony H，Klaus F M，Keith J E，Michael W B，Hall N. Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing. Nature，2012，491∶ 705-710

［20］ Bouktila D，Khalfallah Y，Habachi Y，Mezghani M，Makni M，Makni H. Full-genome identification and characterization of NBS-encoding disease resistance genes in wheat. Mol Genet Genomics，2015，290∶ 257-271

［21］ International Wheat Genome Sequencing Consortium （IWGSC）. A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat （Triticum aestivum） genome. Science，2014，345∶ 1251788

［22］ Shang J，Tao Y，Chen X，Zou Y，Lei C，Wang J，Li X，Zhao X，Zhang M，Lu Z，Xu J，Cheng Z，Wan J，Zhu L. Identification of a new rice blast resistance gene，Pid3，by genome wide comparison of paired nucleotide-binding site leucine-rich repeat genes and their pseudogene alleles between the two sequenced rice genomes. Genetics，2009，182∶ 1303-1311

［23］ Kang Y J，Kim K H，Shim S，Yoon M Y，Sun S，Kim M Y，Van K，Lee S H. Genome-wide mapping of NBS-LRR genes and their association with disease resistance in soybean. BMC Plant Biol，2012，12∶ 139

［24］ Paterson A H，Bowers J E，Bruggmann R，Dubchak I，Grimwood J，Gundlach H，Haberer G，Hellsten U，Mitros T，Poliakov A，Schmutz J，Spannagl M，Tang H，Wang X，Wicker T，Bharti A K，Chapman J，F(xiàn)eltus F A，Gowik U，Grigoriev I V，Lyons E，Maher C A，Martis M，Narechania A，Otillar R P，Penning B W，Salamov A A，Wang Y，Zhang L，Carpita N C，F(xiàn)reeling M，Gingle A R，Hash C T，Keller B，Klein P，Kresovich S，McCann M C，Ming R，Peterson D G，Mehboob-ur-Rahman，Ware D，Westhoff P，Mayer K F，Messing J，Rokhsar D S. The Sorghum bicolor genome and the diversifcation of grasses. Nature，2009，457∶ 551-556

［25］ Cheng Y，Li X，Jiang H，Ma W，Miao W，Yamada T，Zhang M. Systematic analysis and comparison of nucleotide-binding site disease resistance genes in maize. FEBS J，2012，279∶ 2431-2443

［26］ Ma Q H，Zhen W B，Liu Y C. Jacalin domain in wheat jasmonate-regulated protein Ta-JA1 confers agglutinating activity and pathogen resistance. Biochimie，2013，95∶ 359-365

［27］ Guo J，Bai P，Yang Q，Liu F，Wang X，Huang L，Kang Z. Wheat zinc finger protein TaLSD1，a negative regulator of programmed cell death，is involved in wheat resistance against stripe rust fungus. Plant Physiol Biochem，2013，71∶ 164-172

［28］ Deslandes L，Olivier J，Theulieres F，Hirsch J，F(xiàn)eng D X，Bittner-Eddy P D，Beynon J，Marco Y. Resistance to Ralstonias olanacearum in Arabidopsis thaliana is conferred by the recessive RRS1-R gene，a member of a novel family of resistance genes. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99∶ 2404-2409

［29］ Ma Z Q，Wei J B，Cheng S H. PCR-based markers for the powdery mildew resistance gene Pm4a in wheat. Theor Appl Genet，2004，109∶ 140-145

［30］ Yi Y J，Liu H Y，Huang X Q，An L Z，Wang F，Wang X L. Development of molecular markers linked to the wheat powdery mildew resistance gene Pm4b and marker validation for molecular breeding. Plant Breed，2008，127∶ 116-120

［31］ Hao Y，Liu A，Wang Y，F(xiàn)eng D，Gao J，Li X，Liu S，Wang H. Pm23∶ a new allele of Pm4 located on chromosome 2AL in wheat. Theor Appl Genet，2008，117∶ 1205-1212

［32］ Michael Schmolke M，Mohler V，Hartl L，Zeller F J，Hsam S K. A new powdery mildew resistance allele at the Pm4 wheat locus transferred from einkorn （Triticum monococcum）. Mol Breed，2012，29∶ 449-456

［33］ Mohler V，Bauer C，Schweizer G，Kempf H，Hartl L. Pm50∶ a new powdery mildew resistance gene in common wheat derived from cultivated emmer. J Appl Genet，2013，54∶ 259-263

［34］ Bariana H S，McIntosh R A. Cytogenetic studies in wheat∶ XV. Location of rust resistance genes in VPM1 and their genetic linkage with other disease resistance genes in chromosome 2A. Genome，1993，36∶ 476-482

［35］ Eriksen L，Afshari F，Christiansen M J，McIntosh R A，Jahoor A，Wellings C R. Yr32 for resistance to stripe （yellow） rust present in the wheat cultivar Carstens V. Theor Appl Genet，2004，108∶567-575

［36］ Friebe B，Zeller F J，Mukai Y，F(xiàn)orster B P，Bartos P，McIntosh R A. Characterization of rust-resistant wheat-Agropyron intermedium derivatives by C-banding，in situ hybridization and isozyme analysis. Theor Appl Genet，1992，83∶ 775-782

［37］ Chen S，Rouse M N，Zhang W，Jin Y，Akhunov E，Wei Y，Dubcovsky J. Fine mapping and characterization of Sr21，a temperature-sensitive diploid wheat resistance gene effective against the Puccinia graminis f. sp. tritici Ug99 race group. Theor Appl Genet，2015，128∶ 645-656

Genome-Wide Analysis of TaNBS Resistance Genes and Development of Chromosome 2AL-specific NBS-SSR Markers in Wheat

QIAO Lin-Yi1，2，CHANG Jian-Zhong4，GUO Hui-Juan2，GAO Jian-Gang5，ZHENG Jun3，*，and CHANG Zhi-Jian1，2，*1College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2Institute of Crop Science，Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement，Taiyuan 030031，China；3Institute of Wheat Research，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Linfen 041000，China；4Institute of Dryland Farming，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；5Hybrid Technology Engineering Research Center of Wheat，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China

Abstract：Nucleotide binding site （NBS）-encoding genes are the most important resistance genes （R genes） in plant kingdom. In this study，2406 full-length NBS protein sequences，of which single protein varies from 48 aa to 2272 aa，were identified from wheat （Triticum aestivum L.） genome using bioinformatic method. These TaNBSs were divided into four categories，including N，CN，NL，and CNL，according to whether the NBS domains connect CC or LRR domains at both ends. Diagnosis results showed that 1203 of all the scaffolds with TaNBS contained 2177 simple sequence repeats （SSR） loci，73.5% of which were dinucleotide repeat sites. Based on the NBS-SSR loci on chromosome 2AL in wheat，we developed 51 molecular markers，and 39 of them （76.5%） were confirmed as chromosome specific markers using Chinese Spring nulli-tetrasomic and ditelosomic lines. Further-more，24 2AL-specific NBS-SSR markers showed polymorphism between resistant material Khapli carried Pm4a on chromosome 2AL and susceptible material Chancellor. Finally，three 2AL-specific NBS-SSR markers，Sxaas_2AL22，Sxaas_2AL39，and Sxaas_2AL46，were probably linked to Pm4a gene based on genetic linkage test using Pm4a-NILs （Khapli/8*Cc）. These chromosome specific 2AL-NBS-SSR markers can be used to locate novel R genes or screen the candidate sequences for known R genes on chromosome 2AL.

Keywords：Wheat；Disease resistance；NBS-encoding genes；SSR markers；Chromosome 2AL

DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00795

*通訊作者（

Corresponding authors）∶ 暢志堅(jiān)，E-mail∶ wrczj@126.com；鄭軍，E-mail∶ zhengjsxaas@126.com

收稿日期Received（）∶ 2015-10-20；Accepted（接受日期）∶ 2016-03-14；Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-03-21.