初志戰(zhàn)郭海濱曾棟昌劉耀光，*華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用重點實驗室，廣東廣州 5064；華南農(nóng)業(yè)大學公共基礎(chǔ)課實驗教學中心，廣東廣州 5064

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秈粳稻基因組295個InDel標記的開發(fā)

初志戰(zhàn)1郭海濱2曾棟昌1劉耀光1，*1華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用重點實驗室，廣東廣州 510642；2華南農(nóng)業(yè)大學公共基礎(chǔ)課實驗教學中心，廣東廣州 510642

摘 要：插入/缺失（InDel）分子標記具有使用簡單，結(jié)果清晰可靠的優(yōu)點。本研究通過比對粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11的基因組序列，在全基因組范圍內(nèi)設(shè)計了634對InDel候選標記，通過PCR檢測比較2種粳稻（日本晴和臺中65）和2種秈稻（93-11和黃華占）的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)295對標記在2種秈稻間及2種粳稻間均帶型一致，而在秈、粳亞種間有多態(tài)性，因此這套295對標記可以在涉及秈粳亞種的基因定位和分子育種中應用。

關(guān)鍵詞：InDel標記；水稻；基因定位

本研究由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題（SKL-CUSAb-2013-04）和廣東省自然科學基金-博士啟動項目（2015A030310485）資助。

This study was supported by the Open Fund Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources （SKL-CUSAb-2013-04） and the Natural Science Fund of Guangdong Province-the Launch Program for Doctor （2015A030310485）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ chuben@scau.edu.cn

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160314.1444.004.html

自2002年完成水稻基因組測序后，水稻基因組的研究重心開始轉(zhuǎn)向功能基因［1］的鑒定。目前大多水稻基因功能的研究還是以正向遺傳學為主∶ 先通過物理或化學方法誘導基因突變，再經(jīng)過構(gòu)建定位群體，利用分子標記定位和篩選突變基因。分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記后發(fā)展起來的一種更理想的遺傳標記。隨著分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，到目前為止己經(jīng)建立20多種，例如RFLP （restriction fragment length polymorphisms）標記、RAPD （random amplified polymorphic DNAs）標記、AFLP （amplified fragment length polymorphisms）標記等，其中被廣泛用于基因定位的有 SSR （simple sequence repeat）標記、InDel （Insertion/Deletion）標記和SNP （single nucleotide polymorphisms）標記。栽培稻在長期的栽培馴化過程中，形成秈稻和粳稻2個主要的亞種，由于這2個亞種的農(nóng)藝性狀、生理生化特性及基因組序列存在明顯差異，常被用來作為構(gòu)建定位群體的雙親。雙親間DNA序列的多態(tài)性是發(fā)展分子標記的基礎(chǔ)。Shen等［2］比對粳稻（japonica）品種日本晴和秈稻（indica）品種93-11的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)平均每268 bp有1個SNP，每953 bp有1個InDel，這2種標記均有很高的密度，尤其 SNP分子標記在理論上具有極大的潛力，但是目前由于檢測方法的限制，并未廣泛采用SNP分子標記于基因定位尤其是初步定位。SSR標記技術(shù)由Moore等于1991年創(chuàng)立［3］，GRAMENE網(wǎng)站提供了2240個水稻SSR標記（http∶//archive.gramene.org/markers/）。在水稻基因組中平均每157 kb有1個SSR標記［4-5］，而平均每10.36 kb有1個基因［6］，因此SSR分子標記密度還遠未達到圖位克隆的要求。馮芳君等［7］通過測驗20對InDel標記和53對SSR標記在46份粳稻和47份秈稻的遺傳多樣性實驗中發(fā)現(xiàn)，InDel標記的PCR擴增穩(wěn)定性比SSR標記好，擴增產(chǎn)物非特異條帶少，特異性更好，因此分離效果明顯好過 SSR標記。我們的大量應用實踐也表明，InDel分子標記具有使用簡單和電泳結(jié)果比 SSR標記清晰可靠的優(yōu)點。

本研究通過比對日本晴和93-11的全基因組序列，以缺失5～20 bp為標準設(shè)計634對InDel候選標記，以期找出覆蓋全基因組的具有秈粳共同差異的高通用性的InDel標記。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

包括2份秈稻（93-11和黃華占）和2份粳稻（日本晴和臺中65）。

1.2 InDel標記的設(shè)計

以每隔 1～2 Mb的距離從 RGP網(wǎng)站（http∶//rgp.dna. affrc.go.jp/）或者 GRAMENE網(wǎng)站（http∶//www.gramene.org/）下載對應的 BAC克隆序列，然后在 NCBI網(wǎng)站（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）的 BLAST網(wǎng)頁，將此BAC序列與93-11基因組序列進行BLAST比較，以中間缺失 5～20個堿基，兩邊高度保守的區(qū)域為理想的 InDel設(shè)計區(qū)。為了后續(xù)檢測方便，InDel設(shè)計長度一般為100～160 bp，盡量不超過200 bp，引物的Tm值為55～60℃。

1.3 DNA提取方法

在三至四葉期，從4種材料中各選1個單株采集新鮮葉片，以略加修改的SDS法［8］提取葉片基因組總DNA。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

20 μL的PCR體系中包含模板DNA 0.5 μL、10 mmol L-1dNTPs 0.3 μL、10 μmol L-1正反引物各0.5 μL、10 × PCR buffer 2 μL和Taq DNA聚合酶0.5～0.6 U，ddH2O 17 μL。

PCR程序為94℃預變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 25 s，32個循環(huán)；72℃延伸3 min。

1.5 電泳檢測及記錄方法

20 μL PCR產(chǎn)物加4 μL 6×loading buffer于52孔電泳槽，每孔上樣4 μL，8.8%聚丙烯酰胺凝膠180V穩(wěn)壓電泳70 min，用銀染法［9］染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel標記的篩選結(jié)果

對供試的634對候選InDel標記進行PCR檢測，選出在2種秈稻和2種粳稻之間顯示共同多態(tài)的標記（圖1），共獲得 295對秈-粳差異 InDel標記。這些標記在每條染色體上的數(shù)目為14～35個，平均間隔為0.76～1.60 Mb （表1）。這套標記的引物信息列在表2。

圖1 InDel候選標記在4個品種的PCR檢測Fig. 1 Detection of candidate InDel markers among four rice cultivars by PCR amplification

表1 各染色體的InDel標記分布Table 1 Distribution of InDel markers on the chromosomes

表2 秈粳間有共同多態(tài)性的295對InDel標記引物Table 2 Primer sets of 295 InDel markers polymorphic between indica and japonica rice

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

3 討論

水稻不僅是世界上最主要的糧食作物之一，也是遺傳學和基因組研究的模式植物。隨著分子標記種類的不斷開發(fā)，標記數(shù)量的不斷增加，分子標記的應用領(lǐng)域也在不斷拓展。目前分子標記技術(shù)除了被廣泛應用于基因定位外，還大量應用于水稻秈、粳分類［10-12］，作物育種［13］，物種進化關(guān)系研究［14］，作物種子純度鑒定及材料的品種鑒定［15-16］等諸多領(lǐng)域。在水稻基因定位方面，由于InDel分子標記比SSR標記密度更大，因此應用前景更好。本研究獲得295對InDel標記可以作為以秈、粳（尤其是這4種材料）為親本的圖位克隆分子標記。每條染色體上的標記間隔在0.7～1.6 Mb之間，相當于遺傳距離約4～10 cM，基本上可以滿足初定位的需要。

致謝： 本文中有些標記由本實驗室多位研究生提供，在此一并致謝。

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Development of 295 InDel Markers for Indica and Japanica Rice

CHU Zhi-Zhan1，GUO Hai-Bin2，ZENG Dong-Chang1，and LIU Yao-Guang1，*1College of Life Sciences，South China Agricultural University / State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangzhou 510642，China；2Center of Experimental Teaching for Common Basic Course，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China

Abstract：Insertion/Deletion （InDel） markers have advantages of simplicity and reliability for genotyping. We selected 634 candidate InDel markers distributing throughout the 12 chromosomes of rice by comparing genome sequences between the japonica cultivar Nipponbare and the indica cultivar 93-11. PCR results of these candidate markers between two japonica （Nipponbare and Taizhong 65） and two indica （93-11 and Huanghuazhan） cultivars revealed that 295 InDel markers displayed common polymorphisms between the japonica and indica cultivars which are useful for gene mapping and molecular breeding involving in indica and japonica subspecies.

Keywords：InDel marker；Rice；Gene mapping

DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00932

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 劉耀光，E-mail∶ ygliu@scau.edu.cn

收稿日期Received（）∶ 2015-11-09；Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11；Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-03-14.