朱任飛， 顧春燕，盧潮德，吳建軍，吳金柱

(1. 南通市第三人民醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 南通 226001；2. 南通市第三人民醫(yī)院 病理科，江蘇 南通 226001)

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慢性結(jié)石性膽囊炎膽汁膽固醇濃度與膽囊收縮素受體的特點及關(guān)系

朱任飛1， 顧春燕2，盧潮德1，吳建軍1，吳金柱1

(1. 南通市第三人民醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 南通 226001；2. 南通市第三人民醫(yī)院 病理科，江蘇 南通 226001)

[摘要]目的通過檢測慢性結(jié)石性膽囊炎患者膽囊膽汁膽固醇濃度(biliary cholesterol concentration，BCC)及膽囊黏膜上皮A型膽固醇受體(cholecystokinin-A receptor，CCK-AR)蛋白表達強度，明確BCC與CCK-AR的特點及關(guān)系。方法通過免疫組化的方法檢測34例行腹腔鏡手術(shù)的慢性結(jié)石性膽囊炎膽囊黏膜上皮CCK-AR蛋白表達強度，同時用生化方法檢測膽囊內(nèi)膽汁膽固醇濃度，觀察結(jié)果特點并分析相關(guān)性。結(jié)果所有標(biāo)本膽囊黏膜上皮CCK-AR呈陽性表達，其中13例呈弱陽性表達，9例呈中陽性表達，12例呈強陽性表達。膽囊內(nèi)膽汁膽固醇濃度在CCK-AR弱陽性組，CCK-AR中陽性組，CCK-AR強陽性組分別為(14.44±5.51)mmol/L，(11.68±3.41)mmol/L和(6.96±1.19)mmol/L，與CCK-AR表達強度呈負相關(guān)(r=-0.702，P=0.000)。結(jié)論膽汁膽固醇濃度可作為評估膽囊黏膜上皮CCK-AR分子蛋白表達的潛在指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]膽汁膽固醇；膽囊收縮素受體；慢性結(jié)石性膽囊炎

[引用本文]朱任飛，顧春燕，盧潮德，等.慢性結(jié)石性膽囊炎膽汁膽固醇濃度與膽囊收縮素受體的特點及關(guān)系[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016,38(2)：118-120,125.

慢性結(jié)石性膽囊炎已成為影響人類健康的常見病，目前對于膽囊結(jié)石的形成機制仍不清楚。人體內(nèi)膽囊收縮素受體分為A及B，A型膽囊收縮素受體(cholecystokinin-A receptor,CCK-AR)廣泛分布于膽囊黏膜細胞，通過與其配體膽囊收縮素結(jié)合，引起膽囊收縮。動物實驗證實膽汁膽固醇濃度(biliary cholesterol concentration, BCC)升高可引起膽囊收縮素受體減少，從而導(dǎo)致膽囊收縮功能障礙。目前對于人體內(nèi)膽汁膽固醇濃度與膽囊收縮素受體關(guān)系研究較少，本研究用免疫組化方法對膽囊CCK-AR表達進行觀察及測定，并且用生化方法檢測慢性結(jié)石性膽囊炎患者膽囊內(nèi)膽汁膽固醇濃度，探討CCK-AR與BCC的關(guān)系。

1材料和方法

1.1研究對象

選擇2011年1月至2015年6月在南通市第三人民醫(yī)院住院行腹腔鏡手術(shù)治療的膽囊標(biāo)本34例，男11例，女23例，年齡(36.53±11.66)歲，膽囊單發(fā)結(jié)石22例，2枚結(jié)石8例，3枚結(jié)石4例，體重指數(shù)(BMI)(25.06±4.71)kg/m2。取膽囊內(nèi)的膽汁及膽囊底部膽囊壁，經(jīng)病理證實均為慢性結(jié)石性膽囊炎。

1.2方法

1.2.1BCC濃度測定

術(shù)中在膽囊底部，用20 mL空針加氣腹針抽取膽囊中膽汁5～10 mL，將收集到的膽汁放置于15 mL離心管中，置于離心機中，吸取1 mL上清液，用蒸餾水稀釋。將稀釋后的膽汁置于4 ℃冰箱中儲存，20 W日光燈下照射12 h，去除膽色素(主要為膽紅素)。次日應(yīng)用自動生化儀(AU2700)測定膽汁中總膽固醇濃度。試劑盒購自寧波美康生物技術(shù)有限公司。

1.2.2CCK-AR檢測

所有膽囊壁標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化采用Envision二步法，操作參照試劑說明書進行，同時設(shè)PBS代替一抗的陰性對照。一抗Anti-CCK-AR抗體(CCKAR山羊多克隆抗體)及二抗Envision plus試劑盒均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3結(jié)果判定

免疫組化染色結(jié)果采用半定量法進行判定，以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分，在切片的圖像分析中，將細胞核和/或細胞質(zhì)染成黃色的細胞定義為陽性細胞，細胞核和/或細胞質(zhì)染成淡黃色為弱陽性細胞(+)；細胞核和/或細胞質(zhì)染成深黃色為中陽性細胞(++)；細胞核和/或細胞質(zhì)染成棕黃色或褐色為強陽性細胞(+++)。無著色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色或褐色為3分。陽性細胞百分比為自左向右分別計數(shù)第1、3、5、7、9個視野(每400×高倍視野計數(shù)100個此類細胞)的陽性細胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為陰性 (-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。同時為計算BCC與膽囊收縮素CCK-AR表達關(guān)系，以5個視野內(nèi)黏膜上皮CCK-AR蛋白表達陽性細胞總數(shù)來間接表示膽囊CCK-AR表達水平，在高倍(400倍)視野下，自標(biāo)本的一側(cè)自左向右分別計數(shù)第1、3、5、7、9個視野中陽性細胞的個數(shù)，將陽性細胞分別計數(shù)(每種細胞在每例標(biāo)本中觀察5個視野)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果均采用SPSS for Windows 19.0軟件進行統(tǒng)計，CCK-AR與BCC的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1膽囊組織的HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示組織結(jié)構(gòu)完整，細胞核、細胞質(zhì)染色清晰。見圖1。

圖1　膽囊黏膜上皮(HE×100)Fig 1 Gallbladder mucosa (HE×100)

2.2膽囊黏膜上皮CCK-AR表達

免疫組化顯示CCK-AR在黏膜上皮細胞中均有表達，半定量結(jié)果顯示：13例呈弱陽性表達，9例呈中陽性表達，12例呈強陽性表達。見圖2。

圖2　膽囊黏膜上皮CCK-AR受體蛋白表達(×400)Fig 2 The CCK-AR expression in the gallbladder mucosa (×400)A：弱陽性表達；B：中陽性表達；C：強陽性表達

2.3膽汁膽固醇濃度與CCK-AR表達相關(guān)性

膽汁膽固醇濃度在弱陽性，中陽性，強陽性組分別為(14.44±5.51)mmol/L，(11.68±3.41)mmol/L和(6.96±1.19)mmol/L，與CCK-AR表達呈負相關(guān)(r=-0.702，P=0.000)。見圖3。

圖3　膽汁膽固醇濃度與膽囊CCK-AR表達相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis between BCC and CCK-AR expression (n=34)

3討論

慢性結(jié)石性膽囊炎是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，在中國，膽囊結(jié)石的患病率大約為4.3%[1]，有學(xué)者提出了完全腹腔鏡保膽取石術(shù)治療慢性結(jié)石性膽囊炎[2]，對于此種手術(shù)爭議的核心是膽囊結(jié)石的復(fù)發(fā)率問題，有文獻報道膽囊結(jié)石5年復(fù)發(fā)率為6.6%[3]，以及伴隨而來的二次手術(shù)的問題，這就需要探討膽囊結(jié)石的成因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在喂食高膽固醇飲食的家兔中，膽汁中膽固醇含量升高，膽囊收縮功能減弱，膽囊結(jié)石發(fā)病率較正常對照組升高，提示膽汁中膽固醇含量的改變可能是影響膽囊收縮功能的直接因素[4]。Pozo等[5]實驗研究表明，膽汁高濃度膽固醇可以滲透進入膽囊壁，改變膜上相關(guān)受體的活性，導(dǎo)致膽囊內(nèi)膽汁的淤積，并最終形成膽囊結(jié)石。在體外實驗中也觀察到類似現(xiàn)象，膽囊標(biāo)本收縮功能明顯減弱，當(dāng)去除過量的膽固醇后，其膽囊收縮功能有所恢復(fù)[6]，進一步驗證了膽汁膽固醇濃度在膽囊收縮功能障礙產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要的作用，表明膽汁膽固醇濃度是膽囊收縮功能障礙的始動因素，膽汁膽固醇濃度會影響膽囊收縮功能。

膽囊收縮素受體分為A及B，A型膽囊收縮素受體(cholecystokinin-A receptor，CCK-AR)分布于膽囊黏膜，通過與其配體膽囊收縮素結(jié)合，引起膽囊收縮。同時，當(dāng)CCK的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生障礙時，膽囊收縮功能下降，導(dǎo)致膽囊結(jié)石的形成。有學(xué)者通過實驗證明敲除CCK-AR基因的小鼠其膽囊收縮功能減弱，膽囊結(jié)石發(fā)生率較野生型小鼠升高[7]，這表明膽汁膽固醇是通過膽囊收縮素受體，影響膽囊收縮功能。

本研究應(yīng)用免疫組化方法觀察了CCK-AR在膽囊黏膜上皮細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)CCK-AR在膽囊黏膜上皮細胞中有明顯的陽性表達，這與Rai等[8]之前的研究報道相一致，同時本研究分析了CCK-AR表達水平與膽汁膽固醇濃度關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，即膽汁膽固醇濃度越高，膽囊黏膜上皮CCK-AR表達越低，既往有研究顯示細胞膜上高膽固醇環(huán)境的存在使得CCK信號傳導(dǎo)發(fā)生障礙，機體代償增加CCK-AR的含量，維持膽囊收縮功能[9]，筆者考慮膽囊黏膜上皮CCK-AR與膽汁膽固醇濃度相關(guān)性可能跟年齡相關(guān)，這需要實驗進一步證實。本研究提示膽汁膽固醇濃度可作為評估膽囊黏膜上皮CCK-AR分子蛋白表達的潛在指標(biāo)，為進一步研究膽囊動力學(xué)提供了理論依據(jù)。

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Correlation of cholecystokinin receptor expression and biliary cholesterol concentration in chronic calculous cholecystitis

ZHU Ren-fei1, GU Chun-yan2, LU Chao-de1, WU Jian-jun1, WU Jin-zhu1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theThirdPeople'sHospitalofNantong,Nantong226001,China; 2.DepartmentofPathology,theThirdPeople'sHospitalofNantong,Nantong226001,China)

[Abstract]Objective To investigate the relationship of biliary cholesterol concentration and cholesterol cholecystokinin-A receptor expression in chronic calculous cholecystitis. Methods The biliary cholesterol concentration in the gallbladder of 34 cases were tested by biochemistry and cholesterol cholecystokinin-A receptor expression in the gallbladder mucosa of 34 cases were detected by immunohistochemistry. Results The cholesterol cholecystokinin-A receptor (CCK-AR) expression in the gallbladder mucosa of 34 cases showed positive expression, in which weak positive 13 cases, moderate positive 9 cases, and strong positive 12 cases. Bile cholesterol concentration in the weak positive group was (14.44±5.51) mmol/L，in the moderate positive group was (11.68±3.41) mmol/ L, and in the strong positive group was (6.96±1.19) mmol/L. The CCK-AR expression and biliary cholesterol concentration showed negative correlation (r=-0.702，P=0.000). Conclusion The bile cholesterol concentration may be used as potential indicators of CCK-AR expression in chronic calculous cholecystitis, providing a theoretical basis for further study of the gallbladder dynamics.

[Key words]biliary cholesterol; cholecystokinin receptor; chronic calculous cholecystitis

基金項目：南通市衛(wèi)生局青年科研基金項目(WQ2014037)

作者簡介：朱任飛(1986-)，男，江蘇南通人，主治醫(yī)師。E-mail:4392357@qq.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.02.04

[中圖分類號]R602

[文獻標(biāo)志碼]A

文章編號：1671-7295(2016)02-0118-03

(收稿日期：2015-12-06；修回日期：2016-03-13)