于　飛，張文越，梁　璐，楊　軍

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

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2型糖尿病對(duì)雄性小鼠聽(tīng)覺(jué)功能及內(nèi)耳Otoferlin、VGLUT3、Myosin Ⅶa蛋白表達(dá)的影響

于飛，張文越，梁璐，楊軍

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

[摘要]目的觀察2型糖尿病對(duì)雄性小鼠聽(tīng)覺(jué)功能，靜纖毛超微結(jié)構(gòu)和耳畸蛋白(Otoferlin)、囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(vesicle glumate transporter 3，VGLUT3)、肌球蛋白 Ⅶa(MyosinⅦa)蛋白表達(dá)的影響。方法按體重將12只6周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組(對(duì)照組和糖尿病組，n=6)。對(duì)照組小鼠食用飼料含鐵量為(8.26±2.67)mg/kg，糖尿病組小鼠食用飼料含鐵量為(8.39±1.03)g/kg。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及實(shí)驗(yàn)第4、8、12、16周時(shí)測(cè)定小鼠血糖，實(shí)驗(yàn)第16周時(shí)測(cè)定葡萄糖耐量及胰島素耐量，測(cè)定聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位。分離左側(cè)耳蝸基底膜，用免疫熒光法觀察Otoferlin、VGLUT3與Myosin Ⅶa在內(nèi)外毛細(xì)胞的定位與分布。分離右側(cè)半數(shù)耳蝸用作western blot分析蛋白表達(dá)，另外半數(shù)耳蝸分離基底膜，用掃描電鏡觀察內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛形態(tài)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)第8、12、16周，糖尿病組小鼠血糖水平升高，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。糖尿病組小鼠糖耐量減弱，胰島素抵抗指數(shù)升高，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。糖尿病組小鼠聽(tīng)力誘發(fā)電位閾值在刺激頻率為2和3 kHz時(shí)升高，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。糖尿病組小鼠內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛排列正常，未見(jiàn)紊亂及數(shù)目減少；糖尿病組Otoferlin在內(nèi)毛細(xì)胞底部表達(dá)減少，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。 結(jié)論2型糖尿病致雄性小鼠聽(tīng)覺(jué)功能損傷，可能與Otoferlin 蛋白在耳蝸毛細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]聽(tīng)覺(jué)功能；2型糖尿??；耳畸蛋白

[引用本文]于飛，張文越，梁璐，等.2型糖尿病對(duì)雄性小鼠聽(tīng)覺(jué)功能及內(nèi)耳Otoferlin、VGLUT3、Myosin Ⅶa蛋白表達(dá)的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(2)：109-113，117.

糖尿病是以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病，可造成人體微血管和神經(jīng)病變，當(dāng)其對(duì)內(nèi)耳微循環(huán)造成損害時(shí)，會(huì)使聽(tīng)覺(jué)功能表現(xiàn)出不同程度下降。目前，對(duì)糖尿病性聽(tīng)力損傷的發(fā)病機(jī)制主要集中在血管病變、神經(jīng)病變、代謝異常、遺傳基因?qū)W等方面[1]。內(nèi)耳毛細(xì)胞對(duì)于各種耳毒素表現(xiàn)敏感，其數(shù)目、形態(tài)及功能異常可導(dǎo)致聽(tīng)力損傷[2]。Otoferlin、VGLUT3與Myosin Ⅶa蛋白在內(nèi)耳毛細(xì)胞表達(dá)，對(duì)維持正常聽(tīng)覺(jué)功能發(fā)揮重要作用。Otoferlin蛋白屬于ferlin蛋白家族，在成熟小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞特異性表達(dá)，并集中表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞基底膜外側(cè)，Otoferlin與其它突觸前膜蛋白相似，參與膜融合，跟突觸結(jié)合蛋白1、胞漿磷脂酶A2等結(jié)合，并維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度穩(wěn)定，通過(guò)調(diào)控突觸囊泡胞吐作用，參與完成耳蝸帶狀突觸傳遞功能[3]。另外，谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要儲(chǔ)存在神經(jīng)元的囊泡中，并以囊泡的形式運(yùn)輸至神經(jīng)末梢，而VGLUT是負(fù)責(zé)將末梢胞質(zhì)中的谷氨酸逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡中的特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。VGLUT3是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞唯一的VGLUT[4]。而肌球蛋白是真核細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)分子馬達(dá)，對(duì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與傳輸起著重要的作用，其中Myosin Ⅶa就是一類(lèi)在細(xì)胞體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)姆肿樱墓δ軐?duì)于內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育尤為重要。Myosin Ⅶa發(fā)揮內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛的鉚接、胞漿內(nèi)小囊泡和顆粒的運(yùn)動(dòng)[4]。目前鮮見(jiàn)2型糖尿病對(duì)聽(tīng)覺(jué)功能及相關(guān)蛋白表達(dá)影響的報(bào)道。因此本研究擬觀察2型糖尿病對(duì)聽(tīng)覺(jué)功能、內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛及Otoferlin、VGLUT3與Myosin Ⅶa蛋白表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑與儀器

羰基鐵(沈陽(yáng)化學(xué)試劑有限公司)，羊抗鼠耳畸蛋白(Otoferlin)(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗鼠囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(vesicle glumate transporter 3，VGLUT3)(美國(guó)Abcam公司)；兔抗鼠肌球蛋白Ⅶa(Myosin Ⅶa)(美國(guó)Sigma公司)；驢抗羊Alexa Fluor 488 IgG (美國(guó)Invitrogen公司)；DAPI染料(美國(guó)Santa Cruz)；胰島素放免試劑盒(美國(guó)Linco公司)。血糖儀(德國(guó)羅氏公司)；隔聲屏蔽室(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院耳鼻喉科)；誘發(fā)電位儀(美國(guó)Tucker-Davis Technologies公司)；掃描電鏡(日本JEOL公司)，激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理方法

健康6周齡清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠12只(體重為19～21 g)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(遼)2003-0009，CMU62033008]。動(dòng)物雙側(cè)耳廓反射靈敏，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，有良好的通風(fēng)和空氣過(guò)濾系統(tǒng)，室溫21 ℃左右，相對(duì)濕度50%左右，采用燈光照明，明暗各12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體重隨機(jī)分為兩組，每組6只，對(duì)照組小鼠攝入正常飼料，含鐵量為(8.26±2.67)mg/kg飼料，糖尿病組小鼠攝入鐵過(guò)量飼料，含鐵量為(8.39±1.03)g/kg飼料，飼料配方參照以前研究[5]。

1.3血糖及葡萄糖耐量、胰島素抵抗測(cè)定

小鼠分別喂養(yǎng)兩種飼料，在喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)滿4、8、12和16周時(shí)，尾靜脈采血測(cè)血糖或胰島素，在喂養(yǎng)剛好滿16周時(shí)，每組小鼠經(jīng)尾靜脈采血留樣后，從晚12點(diǎn)至次日清晨8點(diǎn)禁食，然后進(jìn)行胰島素抵抗測(cè)驗(yàn)，尾靜脈采血，分離血清，留做空腹血糖、胰島素測(cè)定用，然后將葡萄糖(2 g/kg)或胰島素注射液(0.5 units/只)腹腔注射，分別于15、30、60及120 min，尾靜脈取血，用血糖儀測(cè)定血糖；放免試劑盒測(cè)定胰島素；胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=快速血糖(mg/dL)×快速胰島素(μU/mL)/2430。

1.4聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位閾值檢測(cè)

小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量及胰島素耐量試驗(yàn)后，經(jīng)乙醚麻醉，進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值檢測(cè)。隔聲屏蔽室內(nèi)，保持動(dòng)物體溫，應(yīng)用TDT system 3系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)聽(tīng)。帶通濾波寬度為50～5000 Hz，持續(xù)時(shí)間10 ms，平均疊加次數(shù)1024次。刺激聲為click，短純音刺激在1、2、3、4 kHz下具有1 ms平段，強(qiáng)度范圍為10～90 dB 聲壓級(jí)，衰減間隔10 dB，直至無(wú)法引出可以重復(fù)的聽(tīng)性腦干反應(yīng)波形，然后以5 dB SPL幅度提高刺激強(qiáng)度，以Ⅲ波剛出現(xiàn)的聲刺激強(qiáng)度來(lái)判斷聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位閾值。

1.5 耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛超微結(jié)構(gòu)

小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值檢測(cè)后，斷頭處死，分離右側(cè)耳蝸，取半數(shù)耳蝸，迅速取出顳骨，打開(kāi)聽(tīng)泡，暴露耳蝸后浸入2.5%戊二醛固定液中，灌流后于2.5%戊二醛溶液中4 ℃過(guò)夜，10%乙二胺四乙酸脫鈣液內(nèi)脫鈣7 d；鏡下于0.l mmol/L磷酸鹽緩沖液中剝除蝸殼，去除螺旋韌帶、前庭膜及蓋膜；l %四氧化餓固定2 h；磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次5 min，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋、聚合、修塊，超薄切片機(jī)切片，乙酸鈾和檸檬酸鉛染色，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.6免疫熒光檢測(cè)Otoferlin、VGLUT3與Myosin Ⅶa定位

小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值檢測(cè)后，斷頭處死，分離左側(cè)耳蝸基底膜，用免疫熒光法觀察Otoferlin、VGLUT3與Myosin Ⅶa在內(nèi)毛細(xì)胞的定位與分布。將基底膜置于0.5 %Triton X-100中30 min，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min；用山羊血清封閉后室溫孵育30 min，去封閉液，滴加一抗，濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜，再用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；然后滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光二抗，濕盒中室溫避光孵育1 h；再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。鏡下鋪片，DAPI染核，甘油封片；共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。

1.7Western blot檢測(cè)Otoferlin、VGLUT3與Myosin Ⅶa表達(dá)

小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值檢測(cè)后，斷頭處死，分離右側(cè)半數(shù)耳蝸用作western blot分析蛋白表達(dá)，提取耳蝸總蛋白，用Bradford法定量蛋白濃度，垂直電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行一抗及二抗孵育，曝光后掃描并對(duì)檢測(cè)蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1小鼠一般生理及生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，糖尿病組體重在16周喂養(yǎng)期間增長(zhǎng)減緩，在喂養(yǎng)滿4、8、12和16周時(shí)，糖尿病組體重比對(duì)照組降低，差異有顯著性意義(P<0.05)；血糖水平在喂養(yǎng)8周后明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.05)；HOMA-IR在喂養(yǎng)16周后明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.05)。糖尿病組小鼠血糖水平在葡萄糖耐量結(jié)束時(shí)60、120 min與對(duì)照組比較仍然較高，差異有顯著性意義(P<0.05)，但在葡萄糖耐量結(jié)束時(shí)15、30 min與對(duì)照組比較無(wú)差異；血糖水平在胰島素耐量實(shí)驗(yàn)各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，糖尿病組聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值在2和3 kHz下升高，差異有顯著性意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1　小鼠生理及生化指標(biāo)比較

葡萄糖耐量為注射葡萄糖后血糖水平，胰島素耐量為注射胰島素后血糖水平。1)與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛超微結(jié)構(gòu)

兩組小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛排列規(guī)則，2型糖尿病并未引起小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛自然缺失及束轉(zhuǎn)位。見(jiàn)圖2。

2.4Otoferlin、VGLUT3與MyosinⅦa在小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞中的分布與表達(dá)

如圖3所示，對(duì)照組Otoferlin免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物主要分布于耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞底部，外毛細(xì)胞纖毛也有非特異性著色(圖3A)。糖尿病組Otoferlin免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物分布與對(duì)照組分布相似，但熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖3B)。Western blot結(jié)果顯示，Otoferlin在兩組均有表達(dá)，但糖尿病組的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3C)。

如圖4和5所示，VGLUT3和MyosinⅦa陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色熒光耳蝸基底膜鋪片。Western blot結(jié)果顯示，VGLUT3和Myosin Ⅶa在兩組均有表達(dá)，但差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

圖1　小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值Fig 1 ABR thresholds of mice in 2 groupsA:兩組聽(tīng)閾變化代表曲線圖；B: 聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值*與對(duì)照組比較，P<0.05

圖2　小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛超微結(jié)構(gòu)(標(biāo)尺為10 μm)Fig 2 Ultra-structure of stereocilia in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm)A：對(duì)照組；B：糖尿病組

圖3　小鼠Otoferlin在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)分布(標(biāo)尺為10 μm)Fig 3 The distribution and expression of Otoferlin in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm)A：對(duì)照組(紅色熒光代表Otoferlin，藍(lán)色熒光代表DAPI)；B：糖尿病組； C：兩組Otoferlin蛋白表達(dá)比較 *與對(duì)照組比較，P<0.05

圖4　小鼠VGLUT3在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)分布(標(biāo)尺為10 μm)Fig 4 The distribution and expression of VGLUT3 in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm) A：對(duì)照組(紅色熒光代表VGLUT3，藍(lán)色熒光代表DAPI)；B：糖尿病組；C：兩組VGLUT3蛋白表達(dá)比較

圖5　小鼠Myosin Ⅶa在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)分布(標(biāo)尺為10 μm)Fig 5 The distribution and expression of Myosin Ⅶa in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm) A：對(duì)照組(紅色熒光代表Myosin Ⅶa，藍(lán)色熒光代表DAPI)；B：糖尿病組；C：兩組Myosin Ⅶa蛋白表達(dá)比較

3討論

2型糖尿病可能是聽(tīng)力下降的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其最突出的臨床特征是造成胰島素抵抗，繼而出現(xiàn)高血糖。機(jī)體高血糖會(huì)通過(guò)各種機(jī)制直接或間接損害內(nèi)耳血管及神經(jīng)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽(tīng)力下降[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)攝入含鐵過(guò)多飼料，制造外源性鐵過(guò)載致胰島素抵抗動(dòng)物模型，用來(lái)模擬人群普通2型糖尿病發(fā)生。選用C57BL/6J小鼠，是由于其相對(duì)于其它種類(lèi)小鼠，更容易出現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾[7]，選用雄性小鼠是為了減少自身內(nèi)分泌因素對(duì)建立胰島素抵抗的影響[4]。生理及生化結(jié)果證明動(dòng)物模型后期表現(xiàn)出糖耐量減弱及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，并出現(xiàn)高血糖，提示模型建立成功。但本實(shí)驗(yàn)只設(shè)立一個(gè)劑量，無(wú)法觀察到劑量效應(yīng)關(guān)系，而且糖尿病組小鼠體重明顯低于對(duì)照組動(dòng)物，表明受試物對(duì)動(dòng)物有一定的毒性作用，而毒性可能影響各種觀察指標(biāo)的變化。較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是即使造模也應(yīng)選擇無(wú)明顯毒性而造模又好的劑量。這些將是今后進(jìn)一步相關(guān)試驗(yàn)亟待解決的問(wèn)題。

聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位是測(cè)試聽(tīng)覺(jué)功能的常用臨床方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2型糖尿病引起小鼠高頻段聽(tīng)力損失較重，但低、中頻未表現(xiàn)出明顯損失。另外，本實(shí)驗(yàn)中2型糖尿病小鼠在刺激頻率4 kHz下雖表現(xiàn)聽(tīng)性誘發(fā)電位閾值升高，但差異無(wú)顯著性意義。本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡結(jié)果顯示，在2型糖尿病狀態(tài)下，小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛結(jié)構(gòu)并未損傷。而有文獻(xiàn)報(bào)道，2型糖尿病可引起耳蝸血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)受損[5]。所以推測(cè)，一方面由于小鼠機(jī)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用在一定程度上代償2型糖尿病造成的聽(tīng)力損傷，另一方面由于本實(shí)驗(yàn)造模的方式和糖代謝紊亂的程度與其它研究不同。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，2型糖尿病可引起內(nèi)耳縫隙連接通道功能出現(xiàn)異常，鉀離子再循環(huán)過(guò)程受阻，從而影響內(nèi)淋巴液中鉀離子濃度，破壞內(nèi)淋巴穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)胞變性及耳蝸內(nèi)電位缺失[8]。特別是Otoferlin在成年小鼠耳蝸中僅在內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)，尤其在內(nèi)毛細(xì)胞基底外側(cè)部，集中在帶狀突觸的囊泡上，與內(nèi)流鈣離子結(jié)合，定向釋放到突觸前膜的結(jié)合位點(diǎn)，激活預(yù)先固定于結(jié)合位點(diǎn)處的突觸相關(guān)膜蛋白復(fù)合體，促使突觸囊泡與質(zhì)膜緊密融合，釋放神經(jīng)遞質(zhì)。另外，Otoferlin基因敲除小鼠表現(xiàn)為感音性聾[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2型糖尿病下調(diào)Otoferlin在雄性小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞表達(dá)，表明2型糖尿病可影響內(nèi)毛細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)釋放。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2型糖尿病并未影響小鼠VGLUT3、Myosin Ⅶa在內(nèi)耳毛細(xì)胞的表達(dá)。研究表明，VGLUT3能將耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞末梢谷氨酸逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡中，缺乏VGLUT3的突變小鼠由于內(nèi)耳感覺(jué)毛細(xì)胞和傳入神經(jīng)元之間的谷氨酸傳送缺失，表現(xiàn)聽(tīng)力完全喪失，聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)存在缺陷[4]。表明2型糖尿病未改變耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞谷氨酸傳遞；另一方面，Myosin Ⅶa參與毛細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及遞質(zhì)傳輸功能，Myosin Ⅶa缺失可造成耳聾[4]，由此表明2型糖尿病未改變耳蝸靜纖毛運(yùn)動(dòng)及部分神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸。這與本實(shí)驗(yàn)并未造成2型糖尿病雄性小鼠耳蝸靜纖毛結(jié)構(gòu)改變相一致。因此推測(cè)，2型糖尿病引起聽(tīng)覺(jué)功能異常，可能與Otoferlin表達(dá)下調(diào)相關(guān)。今后筆者將對(duì)2型糖尿病與Otoferlin調(diào)控相關(guān)通路變化作進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Akinpelu OV, Mujica-Mota M, Daniel SJ. Is type 2 diabetes mellitus associated with alterations in hearing? A systematic review and meta-analysis[J]. Laryngoscope, 2014, 124(3):767-776.

[2] Cotanche DA. Genetic and pharmacological intervention for treatment/prevention of hearing loss[J]. J Commun Diso-

rd, 2008, 41(5)：421-443.

[3] 郭旭堯, 袁偉, 張學(xué)淵. Otoferlin蛋白與聽(tīng)毛細(xì)胞突觸傳導(dǎo)[J]. 聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志, 2013, 21(3):320-323.

[4] Liu K, Jiang X, Shi C, et al. Cochlear inner hair cell ribbon synapse is the primary target of ototoxic aminoglycoside stimuli[J]. Mol Neurobiol, 2013, 48(3):647-654.

[5] Dongiovanni P, Ruscica M, Rametta R, et al. Dietary iron overload induces visceral adipose tissue insulin resistance[J]. Am J Pathol, 2013, 182(6):2254-2263.

[6] Bao W, Rong Y, Rong S, et al. Dietary iron intake, body iron stores, and the risk of type 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis[J]. BMC Med, 2012, 10:119.

[7] Lee HS, Kim KR, Chung WH, et al. Early sensorineural hearing loss in ob/ob mouse, an animal model of type 2 diabetes[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol, 2008, 1(4):211-216.

[8] Martjnez AD, Acuna R, Figueroa V, et al. Gap-junction channels dysfunction in deafness and hearing loss[J]. Antioxid Redox signal, 2009, 11(2):309-322．

Effects of type 2 diabetes on auditory function and expression of Otoferlin, VGLUT3 and Myosin Ⅶa proteins in inner ear in male mice

YU Fei, ZHANG Wen-yue, LIANG Lu, YANG Jun

(DepartmentofNutritionandFoodHygiene,SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122,China)

[Abstract]Objective To observe the effects of type 2 diabetes in auditory function, ultrastructure of stereocilia, expression of Otoferlin, VGLUT3 and Myosin Ⅶa proteins inner ear in male mice. Methods Twelve C57BL/6J male mice aged 6 week old were randomly assigned evenly to two groups (control group and diabetic group). Control group and diabetic group was fed a diet with iron content (8.26±2.67) mg/kg and (8.39±1.03) g/kg, respectively. Blood glucose levels were measured before and 4, 8, 12, 16 weeks after iron-content diet feeding. Glucose tolerance test and insulin tolerance test, auditory brainstem response (ABR) test were performed at 16 weeks after iron-content diet feeding. The basilar membranes of the left cochleae were separated for assessment of the location of Otoferlin, VGLUT3 and MyosinⅦa in inner and outer hair cells by immunofluorescence. One half of right cochleae were used for assessment of protein expressions by western blot, the other half were used for assessment of the morphology of stereocilia by scanning electron microscope. Results Compared with control group, blood glucose levels were significantly higher in diabetic group at 8, 12, 16 weeks after iron-content diet feeding (P<0.05); and glucose levels of mice from diabetic group were significantly higher at 0, 60, 120 mins after the end of glucose tolerance test(P<0.05), and HOMA-IR index of mice from diabetic group were significantly higher (P<0.05). The ABR threshold shifts of mice in diabetic group were significantly higher at 2, 3 kHz frequencies (P<0.05). The location of stereocilia of cochlear inner hair cell was normal in mice from diabetic group.The Otoferlin expression in the diabetic group was down-regulated in basal of inner hair cell compared with control group (P<0.05). Conclusion Abnormal auditory function in male mice of diabetic group might be related with the down-regulated expression of Otoferlin protein in cochlear hair cells.

[Key words]auditory function; type 2 diabetics; Otoferlin

作者簡(jiǎn)介：于 飛(1980-)，男，山東牟平人，副教授。E-mail: yufei@mail.cmu.edu.cn

doi:論著10.11724/jdmu.2016.02.02

[中圖分類(lèi)號(hào)]R994.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

文章編號(hào)：1671-7295(2016)02-0109-05

(收稿日期：2015-12-11；修回日期：2016-03-10)