彭靈娟， 叢 喆，薛 婧， 宋銘晶， 魏 強

（北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

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CEMx174細胞中SAMHD1蛋白表達與SIVmac239病毒水平的相關性研究

彭靈娟， 叢 喆，薛 婧， 宋銘晶， 魏 強

（北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

【摘要】目的 研究SIV在感染CEMx174細胞過程中，SAMHD1在基因和蛋白水平的變化與病毒水平之間的相關性。方法 SIVmac239病毒感染CEMx174細胞后，每天收集上清和細胞，應用TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法，檢測細胞內SAMHD1 mRNA的相對表達量的變化；用Western blot檢測SAMHD1蛋白與SIVmac239 P27蛋白表達量的變化，并分析其相關性。結果 CEMx174細胞感染SIVmac239后，細胞中的SAMHD1 mRNA基于內參基因GAPDH的相對表達量逐漸增加，前3 d分別增加了14%，16%，42%，隨后開始迅速增加，第4天達到了200%，第6天更是達到了890%；細胞中SAMHD1蛋白的表達量在感染后第1、2天時變化不大，隨后逐漸降低，到第5、6天時，幾乎檢測不到，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。結論 CEMx174細胞感染SIVmac239后，SAMHD1基因表達上調，與上清中病毒載量水平正相關，細胞內SAMHD1蛋白水平與SIVmac239 P27蛋白水平呈負相關。

【關鍵詞】SAMHD1；HIV-1；SIV；實時熒光定量RT-PCR

SAMHD1是近年來新發(fā)現(xiàn)的抗艾滋病毒（HIV）的天然蛋白質分子，早期研究表明，SAMHD1蛋白作為限制因子，在髓系樹突細胞、巨噬細胞和靜息CD4+T細胞中，發(fā)揮dNTPase功能，通過降低胞內dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期復制［1］，但在感染的活化CD4+T細胞中，卻不能發(fā)揮抗病毒作用［2］。本研究使用SIV病毒感染CEMx174細胞，研究在活化的T細胞感染過程中，SAMHD1在基因和蛋白水平的變化與病毒水平之間的相關性，以期為SAMHD1在活化細胞中的抗病毒作用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞和病毒：CEMx174細胞：由T淋巴細胞干細胞系CEMR.3和B淋巴細胞干細胞系721.174雜交而成的細胞系，病毒感染該種細胞后能表現(xiàn)出明顯的細胞病變的融合現(xiàn)象。毒株：SIVmac239，由本實驗室保存。CEMx174細胞滴定病毒滴度為4× 105TCID50/mL。

1.1.2主要試劑盒：QIAamp RNA Blood Mini Kit購自Qiagen公司（Cat No.52304），TaqMan RNA-to-CT-1-Step Kit購自Applied Biosystems公司（Cat No. 4392938）。

1.2引物和探針

利用 Primer Express 3.0軟件設計 SAMHD1 mRNA（NCBI：NM-001271642）和內參GAPDH的實時熒光定量RT-PCR引物和MGB探針，Invitrogen公司合成（表1）。反應體系總體積20 μL，內含：引物F和R各0.5 μL、TaqMan?RT-PCR Mix（2×）緩沖液10 μL、TaqMan?RT Enzyme Mix（40×）0.3 μL、probe 0.3 μL、DEPC-H2O 3.4 μL、5 μL的模板RNA。反應條件為48℃ 30 min、95℃ 10 min、94℃15 s（×40）、60℃ 60 s（×40）。

1.3實驗方法

1.3.1細胞感染：在3 mL狀態(tài)良好的3×107個CEMx174細胞懸液中，加入 SIVmac239病毒原液100 μL，37℃孵育2 h，補足 RPMI1640生長液至30 mL。

1.3.2樣本收集和處理：在 CEMx174細胞感染SIVmac239病毒后的第0、1、2、3、4、5、6天，分別取4 mL的細胞懸液，離心。提取上清液中病毒RNA，real-time RT-PCR檢測病毒載量水平變化［3］。

離心后的細胞沉淀，一半用來提取細胞RNA，在mRNA水平檢測SAMHD1的表達量的變化，即采用熒光定量 RT-PCR檢測獲得的 CT值，利用△△CT法，即2-△△CT計算各個時間點的樣本基于內參基因GAPDH的相對表達量［4］。另一半細胞裂解，提取蛋白，利用Western blot檢測SAMHD1蛋白的表達量和病毒的p27蛋白的表達量的變化［5］。

1.4統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 5.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。

2　結果

2.1細胞病變

在CEMx174細胞感染SIVmac239病毒后細胞狀態(tài)發(fā)生改變，會出現(xiàn)明顯細胞融合。在感染后第3天就可看到早期融合細胞的產生（圖1B），在第6天，鏡下觀察有大量的融合細胞產生（圖1C）。

2.2SIVmac239感染 CEMx174細胞中的SAMHD1 mRNA相對表達量與病毒載量之間的相關性分析

表1　Real-time RT-PCR測定的PCR擴增引物和探針Tab.1 Primers and probes used for the real-time RT-PCR detection

SIVmac239感染CEMx174細胞后，感染上清液中的病毒RNA水平逐漸升高，從第1天的1×104copies/mL左右，到第6天增長到1×108copies/mL（圖2A）。CEMx174細胞中的SAMHD1 mRNA基于參內基因GAPDH的相對表達量，在前3 d分別比第0天增加了14%，16%，42%，呈現(xiàn)緩慢增加趨勢。隨后開始迅速增加，第4天達到了200%，第6天更是達到了890%（圖2B）。

SAMHD1 mRNA相對表達量與培養(yǎng)上清中病毒RNA載量呈正相關，R=0.6673，P＜0.01；（圖2C）。

2.3SIVmac239感染 CEMx174細胞中的SAMHD1和P27蛋白表達水平變化

CEMx174細胞感染 SIVmac239后，細胞中SAMHD1蛋白的表達量在第1、2天時變化不大，隨后逐漸降低，到第5、6天時，幾乎檢測不到（圖3A）。在整個感染過程中，SAMHD1蛋白的表達量總體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。而細胞中SIV病毒P27蛋白的含量卻呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢。在感染后的第2天已經可以檢測到P27蛋白，之后4 d表達量持續(xù)增加。SIVmac239病毒的P27蛋白與SAMHD1蛋白的表達量呈顯著負相關，R=-0.8957，P＜0.0001。

圖1　SIVmac239病毒感染CEMx174細胞后產生細胞病變Note.：The site of cell fusion bulbs；A：Normal CEMx174 cells；B：The CPE of CEMx174 cells 3 days post infection with SIVmac239；C：The CPE of CEMx174 cells 6 days post infection with SIVmac239Fig.1 The cytopathic effect（CPE）of CEMx174 cells infected with SIVmac239

圖2　SIVmac239感染CEMx174細胞中SAMHD1 mRNA相對表達量和上清中病毒載量的變化及兩者之間相關性分析Note.A：The changes of viral loads；B：The change of SAMHD1 mRNA relative expression；C：The correlation between viral loads and SAMHD1 mRNA relative expressionFig.2 The relationship between the relative expression of SAMHD1 mRNA and the viral RNA level in SIVmac239-infected CEMx174 cells

3　討論

早期研究表明，SAMHD1做為天然抗艾滋病毒的蛋白質分子，在髓系樹突細胞、巨噬細胞和CD4+靜息T細胞中，通過降低胞內dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期復制［6］，低的 dNTP水平被認為是SAMHD1蛋白抑制病毒復制的重要指標。然而，WY Gao等人［7，8］發(fā)現(xiàn)活化的CD4+T細胞感染后，dNTP含量沒有明顯下降，且顯著高于靜息細胞中dNTP水平，因此認為在活化的T細胞中，SAMHD1蛋白不具有抗病毒作用。然而最新研究表明，SAMHD1蛋白除了通過降解dNTP來發(fā)揮抑制病毒復制的作用，還能發(fā)揮 RNase的功能來抗病毒［7，9，10］。因此，在活化的CD4+T細胞中，dNTP的含量比較高，并不能說明SAMHD1蛋白就沒有發(fā)揮抗病毒功能。

CEMx174細胞是由 T淋巴細胞干細胞系CEMR.3和B淋巴細胞干細胞系721.174雜交而成的細胞系，被SIV病毒感染后能產生明顯的細胞病變。本研究中，CEMx174細胞感染SIVmac239病毒后，隨著培養(yǎng)上清液中的病毒載量快速升高，細胞中病毒 P27蛋白的表達水平也增加迅速。而SAMHD1的mRNA相對表達量在4 d后顯著增加，與病毒載量呈正相關，可見細胞在感染過程中，上調了SAMHD1基因的表達；與之相反的是細胞中SAMHD1蛋白表達量從4 d后逐漸下降，第5～6天時基本檢測不到，與SIV病毒P27蛋白量呈顯著負相關。

前期研究表明，一些慢病毒如HIV-2和SIV，可以編碼Vpx蛋白來抑制細胞內抗病毒復制的蛋白。HIV-2和一些 SIV編碼的 Vpx蛋白，通過加載SAMHD1蛋白到CRL4DCAF1E3泛素連接酶上誘導SAMHD1蛋白酶體降解，通過降解SAMHD1蛋白可以促進HIV-1病毒的反轉錄產物cDNA的積累，同時也明顯促進人的單核細胞、及其來源的樹突細胞和巨噬細胞的HIV-1的感染［11］。在其他SAMHD1限制感染的細胞，如星形膠質細胞中，Vpx也能發(fā)揮降解SAMHD1功能，促進這些細胞的感染［12］。本研究使用的CEMx174細胞中的SAMHD1蛋白表達量的降低，可能與SIVmac239病毒產生的Vpx蛋白降解SAMHD1蛋白有關。SAMHD1蛋白在活化的細胞中是否發(fā)揮抗病毒的功能有待進一步證實，但本研究中發(fā)現(xiàn)感染SIV的CEMx174細胞SAMHD1基因上調，蛋白含量下降，說明SAMHD1在感染過程中是起作用的。廣譜表達的SAMHD1蛋白可能具有廣譜的抗病毒作用，不只是在靜息CD4+T細胞或髓系細胞中發(fā)揮作用。

圖3　SIVmac239病毒感染CEMx174細胞中的SAMHD1、P27蛋白表達量檢測及相關性分析Note.A：Western blot showing expression of SIV P27 and SAMHD1 in SIV-infected CEMx174 cells；B：The relative expression of SIV P27 and SAMHD1 in SIV-infected CEMx174 cells；C：The correlation between SAMHD1 protein and P27 proteinFig.3 The correlation between the expression of SAMHD1 protein and the P27 protein in SIVmac239-infected CEMx174 cells

參考文獻：

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〔修回日期〕2016-02-01

Relationship between the SAMHD1 protein expression and the SIVmac239 viral level in CEMx174 cells

PENG Ling-juan，CONG Zhe，XUE Jing，SONG Ming-jing，WEI Qiang
（Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College（PUMC）&Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）；Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

【Abstract】Objective To explore the relationship between protein levels of SAMHD1 expression with viral load of SIV in the SIVmac239-infected CEMx174 cells.Methods CEMx174 cells were infected with SIVmac239，and the cells and supernatant were collected daily for analysis.The viral loads and the SAMHD1 mRNA level were detected by real-time RT-PCR and the level of P27 and SAMHD1 proteins were detected by Western blotting.Results The mRNA level of intracellular SAMHD1 gene was increased and SAMHD1 protein decreased gradually when CEMx174 cells were infected with SIVmac239.Conclusions There is a positive correlation between viral load in the supernatant and the mRNA level of SAMHD1，and a negative correlation between the increase of P27 protein and the decrease of SAMHD1 protein in the SIVmac239-infected CEMx174 cells.

【Key words】SAMHD1；HIV-1；SIV；Real-time RT-PCR

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0041-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.007

［基金項目］國家十二五科技重大專項課題（2013ZX10004608-003和2012ZX10004501-001）。

［作者簡介］彭靈娟（1991-），女，碩士研究生，專業(yè)：動物學，從事實驗動物病毒學研究工作。

［通訊作者］魏強（1964-），男，研究員，博士生導師，研究方向：實驗動物病毒學。E-mail：weiqiang0430@cnilas.org。