李曉華，吳金龍，郭　佳，陶新園，梅　楓，馬婷婷，皮　婷，劉　濤，沈　冬

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

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具有抗農(nóng)作物病原真菌活性的鏈霉菌IIR21菌株中attB位點的分析

李曉華，吳金龍，郭佳，陶新園，梅楓，馬婷婷，皮婷，劉濤，沈冬

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

摘要以7種農(nóng)作物病原真菌為指示菌，采用菌塊法和杯碟法測定了鏈霉菌IIR21菌株次級代謝產(chǎn)物的抗農(nóng)作物病原真菌活性，用PCR方法擴(kuò)增了鏈霉菌IIR21菌株的attB的序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析.結(jié)果表明：鏈霉菌IIR21菌株對稻瘟病菌、立枯絲核病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性；鏈霉菌IIR21菌株的attB位點序列長269 bp，它與Streptomycesnatalensis的attB位點核心區(qū)域的序列的相似度最高，達(dá)到92%，具有發(fā)生交換的核心區(qū)域5′-TT.含有ΦC31attP 位點的整合型質(zhì)粒pSET152可通過attP 位點與鏈霉菌IIR21菌株的染色體上的attB位點發(fā)生位點特異性重組.

關(guān)鍵詞鏈霉菌IIR21菌株；抗真菌活性；attB位點

位點特異性重組是發(fā)生在兩條DNA 鏈特異位點上的重組，重組的發(fā)生需要附著位點和重組酶參與催化[1-3].位點特異性重組酶可分為兩個家族：酪氨酸家族和絲氨酸家族[4].λ噬菌體屬于酪氨酸家族；鏈霉菌噬菌體ΦC31的整合酶是從鏈霉菌噬菌體ΦC31中得到的，該酶是不同于λ噬菌體整合酶的另一種類型整合酶，屬于絲氨酸家族[5].它不僅能高效重組噬菌體染色體attP位點與宿主染色體上的attB位點，而且能高效地將攜帶attP位點的質(zhì)粒DNA 整合入哺乳動物細(xì)胞染色體上假attB位點[6]，該反應(yīng)不需要其他輔助因子.應(yīng)用ΦC31重組系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)粒DNA在小鼠體內(nèi)的長期表達(dá)[7].

attB位點為鏈霉菌染色體上特異性重組位點，在變鉛青鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌等鏈霉菌中廣泛存在.含有attP位點的質(zhì)粒，如利用鏈霉菌噬菌體ΦC31所構(gòu)建的整合型載體pSET152，可以通過質(zhì)粒上的attP位點與attB位點特異性重組，整合入染色體后穩(wěn)定存在[6].因此位點特異性重組被作為工具廣泛應(yīng)用于鏈霉菌分子遺傳學(xué)研究中，Penn等[8]應(yīng)用位點特異性重組在變鉛青鏈霉菌中異源表達(dá)了達(dá)托霉素的基因簇并獲得了產(chǎn)物.

本研究以7種農(nóng)作物病原真菌為指示菌，用菌塊法和杯碟法測定鏈霉菌IIR21菌株次級代謝產(chǎn)物的抗農(nóng)作物病原真菌活性，用PCR方法擴(kuò)增鏈霉菌IIR21菌株的attB的序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析.

1材料和方法

1.1材料和儀器

鏈霉菌IIR21菌株，大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，7種農(nóng)作物病原真菌為稻瘟病菌168菌株(Magnaporthegrisea168菌株)、稻瘟病菌NO-1菌株(MagnaporthegriseaNO-1菌株)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliaekleb)、禾谷鐮刀菌(Fusariumaminearum)、腐霉病菌(Botrytiscinerea)、黃色鐮刀病菌(Fusariumculmorum).以上菌株均由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物實驗室保存. pSET152是一種整合型質(zhì)粒[9]，含有阿伯拉抗性基因aac(3)IV、pUC18復(fù)制子ori、鏈霉菌噬菌體ΦC31整合基因和attP位點、接合轉(zhuǎn)移起始位點oriT.

高氏I號培養(yǎng)基用于鏈霉菌IIR21菌株的固體培養(yǎng)；高氏I號液體發(fā)酵培養(yǎng)基、菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基[10]；優(yōu)化菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基[10]用于鏈霉菌IIR21菌株的液體培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基用于7種農(nóng)作物病原真菌的菌體培養(yǎng). PCR擴(kuò)增引物合成和純化產(chǎn)物的測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成.

超凈工作臺(SW-CJ-1BU, 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，生化培養(yǎng)箱 (SPX-250BS-II, 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，高壓滅菌鍋(YXQG02,山東新華區(qū)醫(yī)療器械廠)，PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀 (PTC-200, Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(TFL-40, Synoptics公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (DYY-5, 北京市六一儀器廠)，阿伯拉抗生素、萘啶酮酸、PCR所用試劑均購自TAKARA公司.

1.2鏈霉菌IIR21菌株抑菌活性的測定

利用菌塊法[11]和杯碟法[12]測定鏈霉菌IIR21菌株次級代謝產(chǎn)物的抗真菌活性，利用十字測量法測定抑菌圈直徑.

1.3鏈霉菌IIR21菌株attB位點的PCR擴(kuò)增

上游引物attB1:5′-CGGATCCGACCC(G/C)TTCA-CATGATGGAC-3′,下游引物attB2:5′-TGGAatt

CAGGTT(G/C)ACCCA(C/G)AGCTG(G/C)AG-3′.PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃ 1 h. 將PCR產(chǎn)物純化后測序.

1.4鏈霉菌與大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移

鏈霉菌與大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移的方法參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行.

2結(jié)果和分析

2.1鏈霉菌IIR21菌株的抗農(nóng)作物病原真菌活性

以7種農(nóng)作物病原真菌為指示菌，利用菌塊法和杯碟法篩選出一株具有抗農(nóng)作物病原真菌活性鏈霉菌IIR21菌株，其抗真菌活性如表1所示.由表1可見，鏈霉菌IIR21菌株對7種農(nóng)作物病原真菌均有不同程度的抑菌活性，其中鏈霉菌IIR21菌株的菌塊對稻瘟病菌168菌株、稻瘟病菌NO-1菌株、立枯絲核病菌、黃色鐮刀病菌的抑菌圈直徑大于40 mm；其發(fā)酵液對稻瘟病菌168菌株、稻瘟病菌NO-1菌株、立枯絲核病菌的抑菌圈直徑也大于40 mm，表明鏈霉菌IIR21菌株對稻瘟病菌、立枯絲核病菌有較強(qiáng)的抑菌活性.

表1鏈霉菌IIR21菌株對7種農(nóng)作物病原真菌的

Tab.1Antifungal activity ofStreptomycessp.IIR21 strain against

seven crop pathogenic fungi

7種農(nóng)作物病原真菌鏈霉菌IIR21的抑菌圈直徑/mm菌 塊發(fā)酵液稻瘟病168菌株40.92±0.4753.31±0.86稻瘟病NO-1菌株47.39±0.4260.47±2.56立枯絲核病菌55.03±0.8142.37±0.85黃色鐮刀病菌44.55±0.9118.89±0.41禾谷鐮刀病菌36.73±0.6030.26±2.76腐霉病菌34.25±0.8431.67±0.77棉花黃萎病菌17.45±1.060

2.2鏈霉菌IIR21菌株的attB位點的克隆和分析

以鏈霉菌IIR21菌株的基因組DNA為模板，用噬菌體ΦC31的attB位點保守序列設(shè)計的一對引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條大小約為260 bp片段(見圖1).

M) DL2000 Maker；A) 鏈霉菌IIR21菌株attB位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1　鏈霉菌IIR21菌株attB位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1　The PCR amplification of attB site of Streptomycessp.IIR21 strain

對擴(kuò)增的大小約為260 bp片段進(jìn)行回收、測序和生物信息學(xué)分析，鏈霉菌IIR21菌株的attB位點序列長269 bp.與NCBI上的序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2所示，鏈霉菌IIR21菌株的attB位點與S.natalensis的attB位點核心區(qū)域的序列的相似度最高，達(dá)到92%，與S.rimosusR7、S.acidiscabies、S.ambofaciens的attB位點核心區(qū)域序列的相似度分別為90%、87%、87%.比對結(jié)果表明：attB位點核心區(qū)域的序列是高度保守的，僅有少數(shù)位點堿基是可變的.通過對S.ambofaciens的attB和attP位點的比對分析，表明核心序列(發(fā)生交換的區(qū)域)是5′-TTG[14]，進(jìn)一步的研究[6]表明核心序列(發(fā)生交換的區(qū)域)為5′-TT，鏈霉菌IIR21菌株的attB序列也具有5′-TT序列(如圖2星號所標(biāo)示).

圖2　鏈霉菌IIR21菌株attB位點序列與其他鏈霉菌的比對Fig.2　Alignment of sequences of attB sites in Streptomyces sp.IIR21 strain and various species of Streptomyces

2.3鏈霉菌IIR21菌株的attB位點的驗證

鏈霉菌IIR21菌株含有attB位點，可以與attP 位點之間發(fā)生位點特異性重組.用含有ΦC31attP 位點的整合型質(zhì)粒pSET152通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入鏈霉菌IIR21菌株，獲得了具有阿伯拉霉素抗性的鏈霉菌IIR21∷pSET152接合轉(zhuǎn)移子.提取鏈霉菌IIR21∷pSET152接合轉(zhuǎn)移子的總DNA，用限制性內(nèi)切酶BamH I分別酶切質(zhì)粒pSET152和鏈霉菌IIR21∷pSET152接合轉(zhuǎn)移子總DNA，用質(zhì)粒pSET152作探針與鏈霉菌IIR21∷pSET152接合轉(zhuǎn)移子總DNA進(jìn)行雜交，結(jié)果表明：質(zhì)粒pSET152通過attP 位點與鏈霉菌IIR21菌株的染色體上的attB位點發(fā)生位點特異性重組.

3結(jié)語

鏈霉菌是一類非常重要的微生物資源，其次生代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，在發(fā)現(xiàn)新穎化合物方面具有巨大的潛能.鏈霉菌分子生物學(xué)研究已在抗生素生物合成基因的克隆、雜合抗生素產(chǎn)生等方面取得了重要的進(jìn)步[15].

本實驗室從湖北省襄陽煙葉種植土壤中分離得到的菌株中[16]，篩選了一株鏈霉菌，命名為IIR21，本研究以7種農(nóng)作物病原真菌為指示菌，用菌塊法和杯碟法測定了鏈霉菌IIR21菌株次級代謝產(chǎn)物的抗農(nóng)作物病原真菌活性，鏈霉菌IIR21菌株稻瘟病菌、立枯絲核病菌有較強(qiáng)的抑菌活性.鏈霉菌IIR21菌株的attB位點序列長269 bp，與S.natalensis的attB位點核心區(qū)域的序列的相似度最高，達(dá)到92%，具有發(fā)生交換的核心區(qū)域5′-TT.含有ΦC31attP 位點的整合型質(zhì)粒pSET152通過attP 位點與鏈霉菌IIR21菌株的染色體上的attB位點發(fā)生位點特異性重組.

參考文獻(xiàn)

[1]Bode J, Schlake T, Iber M, et al. The transgeneticist′s toolbox: novel methods for the targeted modification of eukaryotic genomes[J]. Biol Chem, 2000, 381(9/10): 801-813.

[2]Kolb A F.Genome engineering using site-specific recombinases[J].Cloning Stem Cells,2002,4(1):65-80.

[3]Coates C J, Kaminski J M, Summers J B, et al. Site-directed genome modification: derivatives of DNA-modifying enzymes as targeting tools[J]. Trends Biotechnol， 2005, 23(8): 407-419.

[4]Helena M, Margaret C M, et al.Invitrosite-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvasey/invertase family[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(10): 5505-5510.

[5]Thorpe H M, Wilson S E, Smith M C. Control of directionality in the site-specific recombination system of theStreptomycesphageφC31[J]. Mol Microbiol, 2000, 38(2):232-241.

[6]Combes P, Till R, Bee S, et al. TheStreptomycesgenome contains multiple pseudo-attB sites for the phiC31-encoded site-specific recombination system[J]. J Bacteriol,2002, 184(20): 5746-5752.

[7]Olivares E C, Hollis R P, Chalberg T W, et al. Site-specific genomic integration produces therapeutic factor IX levels in mice[J]. Nat Biotechnol, 2002, 20(11) :1124-1128.

[8]Penn J, Li X, Whiting A, et al. Heterologous production of daptomycin inStreptomyceslividans[J]. Microbiol Biotechnol, 2006, 33(2): 121-128.

[9]李曉華，楊振飛，李陽，等. 小單孢菌40027 菌株內(nèi)源質(zhì)粒pJTU101的特性及其抗性標(biāo)記[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 34(1): 33-35.

[10]譚暉，李匯龍，李文鑫，等.抗真菌土壤放線菌的篩選鑒定、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵液穩(wěn)定性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012, 51(9): 1771-1774.

[11]Boudjella H, Bouti K, Zitouni A, et al. Taxonomy and chemical characterization of antibiotics ofStreptosporangiumSg10 isolated from a Saharan soil[J]. Microbiol Res, 2006, 161, 4(17): 288-298.

[12]趙剛，吳元華.一株鏈霉菌發(fā)酵液的抗菌譜及穩(wěn)定性[J].農(nóng)藥, 2006,45(8):15-33.

[13]Flett F,Mersinias V,Smith C P.High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA fromEscherichiacolito methyl DNA-restrictingStreptomycetes[J]. FEMS Microbiol Lett, 1997,155:223-229.

[14]Kuhstoss S,Rao R N.Analysis of the integration function of theStreptomycetebacteriophage phi C31[J]. J Mol Biol, 1991, 222(4): 897-908.

[15]Bierman M, Logan R, O′Brien K, et al. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichiacolitoStreptomycesspp. [J].Gene, 1992,116(1): 43-49.

[16]李曉華，楊曉潼，翟貴發(fā)，等.煙堿降解菌DAB2 菌株的篩選、鑒定和降解特性[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 32(3): 18-21.

Analysis ofattB Site inStreptomycessp.IIR21 Resistance to Crop Pathogenic Fungi

LiXiaohua,WuJinlong,GuoJia,TaoXinyuan,MeiFeng,MaTingting,PiTing,LiuTao,ShenDong

( Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission，College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

AbstractThe antifungal activity of the secondary metabolite ofStreptomycessp.IIR21 strain was detected through the agar block method and cylinder plate method with seven crop pathogenic fungi as indicators. TheattB site sequence for site specific recombination was cloned by PCR and analyzed by bioinformatics. The results indicated thatStreptomycessp.IIR21 strain exhibited much stronger antifungal activity againstMagnaporthegriseaandRhizoctoniasolani. TheattB site sequence of theStreptomycessp.IIR21 strain was of a length of 269 bp, and is most similar to theattB site core region ofStreptomyces.natalensis, with similarity reaching 92%, and contain the core cross-over region 5′-TT. The integrative plasmid pSET152 including ΦC31attP site recombined specifically between theattP site in pSET152 and theattB site in the chromosome ofStreptomycessp.IIR21 strain.

KeywordsStreptomycessp.IIR21 strain; antifungal activity;attB site

收稿日期2016-01-13

作者簡介李曉華(1968-)，男，教授，博士，研究方向：微生物學(xué)，E-mail: lixiaohua@mail.scuec.edu.cn

基金項目國家自然科學(xué)基金資助項目(31070087)；湖北省自然科學(xué)基金重點資助項目(2011CDA079,2008CDB076,BZY14009)；中南民族大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(YCZW15104)；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練資助項目(GCX15005)

中圖分類號Q933

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號1672-4321(2016)02-0019-04