.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　2.廈門(mén)市科環(huán)海洋生物科技有限公司　周　勇　鄭　毅

?

類(lèi)球紅細(xì)菌輔酶Q10發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化*

1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2.廈門(mén)市科環(huán)海洋生物科技有限公司周勇1,2鄭毅1

[摘要]為了提高類(lèi)球紅細(xì)菌輔酶Q10的發(fā)酵能力，本研究對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中重要因子進(jìn)行優(yōu)化組合。首先對(duì)重要因子進(jìn)行單因子實(shí)驗(yàn)，確定最佳濃度范圍。在最佳濃度范圍內(nèi)進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別采用多項(xiàng)式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項(xiàng)）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項(xiàng)）分析。結(jié)果表明，偏最小二乘二次回歸分析的優(yōu)化方案預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值最為接近，顯示各因子濃度與輔酶Q10濃度呈現(xiàn)二次曲線關(guān)系，各因子間的交換作用不能忽略。偏最小二乘二次回歸分析優(yōu)化方案使輔酶Q10濃度得到明顯提高，輔酶Q10的發(fā)酵水平達(dá)到230.71mg.L-1，比優(yōu)化前提高了53.81%。

[關(guān)鍵詞]類(lèi)球紅細(xì)菌輔酶Q10均勻設(shè)計(jì)偏最小二乘二次回歸

輔酶Q（Coenzyme Q，CoQ）又稱(chēng)泛醌（Ubiquinone），是自然界中廣泛存在的脂溶性醌類(lèi)化合物，存在于原核生物的細(xì)胞膜或真核生物的線粒體內(nèi)膜的磷脂雙分子層的疏水區(qū)域中。輔酶Q是有氧呼吸電子傳遞鏈的重要遞氫體，同時(shí)也是一種天然的抗氧化性劑和非特異免疫增強(qiáng)劑，在多種疾病中具有良好的輔助醫(yī)療效果[1, 2]。

目前輔酶 Q10的制備方法有三種：動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵生產(chǎn)法[3]。由于微生物發(fā)酵法的產(chǎn)物為天然物質(zhì)，生物活性高、容易被人體吸收[4]，成為制備輔酶 Q10最有潛力的方法與研究熱點(diǎn)。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化是提高微生物代謝產(chǎn)物積累水平最有效的辦法。于子玲等[5]采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box- Behnken響應(yīng)面分析方法對(duì)輔酶Q10生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后輔酶Q10產(chǎn)量為51.31mg/L，比優(yōu)化前提高了 99.34%。邵玲莉等[6]對(duì)輔酶Q10生產(chǎn)菌鞘氨醇單胞菌YZ0803的發(fā)酵條件進(jìn)行探討及組分的正交試驗(yàn)優(yōu)化，在搖瓶水平上，輔酶 Q10的最終濃度高達(dá)192mg/L，比優(yōu)化前提高了39.13%。

均勻設(shè)計(jì)法[7]是一種常用的因子優(yōu)化組合方法，它利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模，通過(guò)局部試驗(yàn)回歸，擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，從而能獲得比較準(zhǔn)確的優(yōu)化組合。

本文先采用單因子實(shí)驗(yàn)，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重要成分的適宜濃度范圍。在單因子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)重要因子進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分別采用二次多項(xiàng)式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項(xiàng)）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項(xiàng)）分析，以期提高類(lèi)球紅細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10的發(fā)酵水平。

1　材料和方法

1.1菌株

類(lèi)球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides），本實(shí)驗(yàn)室選育保藏。

1.2培養(yǎng)基

（1）瓊脂平板培養(yǎng)基（單位：g·L-1）：葡萄糖18、酵母粉4.5、味精2、(NH4)2SO45.25、MgSO48.75、KH2PO41.5、FeSO41.2、NaCl4.2、瓊脂粉 20。

（2）種子培養(yǎng)基：與瓊脂平板培養(yǎng)基相同，但不添加瓊脂，另外添加0.5% CaCO3作為pH緩沖劑。

（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（單位：g·L-1）：葡萄糖20、玉米漿粉3.5、味精2.5、(NH4)2SO44.0、MgSO41.0、KH2PO41.2、FeSO41.6、NaCl 3.5、A 0.1、B 0.1，添加1% CaCO3作為pH緩沖劑。

1.3培養(yǎng)方法

從活化的瓊脂平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落，接入裝有20mL種子培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，在溫度 32℃、轉(zhuǎn)速220r/min下培養(yǎng)24h，作為搖瓶種子液；按10%接種量，將種子液接入 45mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在溫度32℃、轉(zhuǎn)速220r/min下培養(yǎng)48h。

1.4輔酶Q10的提取及檢測(cè)

采用超聲波提取法[8, 9]破碎細(xì)胞，獲得輔酶 Q10；采用HPLC法[10]測(cè)定輔酶Q10濃度。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

（1）采用單因子實(shí)驗(yàn)，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重要成分的最佳濃度范圍。

（2）在Data Processing Statio（DPS)7.05軟件中對(duì)重要因子進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分別采用二次多項(xiàng)式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項(xiàng)）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項(xiàng)）分析，得出不同的優(yōu)化方案。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定輔酶 Q10發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳優(yōu)化組合。

2　結(jié)果與分析

2.1重要組分的單因子濃度實(shí)驗(yàn)

在輔酶Q10基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，分別對(duì)葡萄糖、玉米漿粉、(NH4)2SO4、味精進(jìn)行單因子優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖4。

圖1　葡萄糖對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

圖2　玉米漿粉對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

圖3　(NH4)2SO4對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

圖4　味精對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

由圖1～圖4可初步確定這4種成分的最佳濃度范圍：葡萄糖25~40g·L-1、玉米漿粉5~9g·L-1、(NH4)2SO43~7g·L-1、味精5~9g·L-1。

2.2均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)表格及實(shí)施

在葡萄糖、玉米漿粉、(NH4)2SO4、味精的單因子濃度基礎(chǔ)上，按照均勻設(shè)計(jì)表U15（54）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子濃度安排水平見(jiàn)表1。

表1　均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平

將上述4種組分的濃度水平按照DPS7.05軟件自動(dòng)生成的均勻設(shè)計(jì)表U15（54）排列，培養(yǎng)基其他組分濃度按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　4種培養(yǎng)基成分均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化

2.3均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1二次多項(xiàng)式逐步回歸分析

采用二次多項(xiàng)式逐步回歸分析法對(duì)表2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到以下數(shù)學(xué)模型方程：

此回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，表明方程有效。總體顯著性檢驗(yàn)值 F=222.25，顯著水平 P=0.05，表明該模型可信度高。其優(yōu)化組合為：葡萄糖38g·L-1、(NH4)2SO47.5 g·L-1、味精6.0 g·L-1、玉米漿粉7.0 g·L-1。結(jié)果表明，輔酶Q10積累濃度為221m g·L-1，與模型預(yù)測(cè)值（249mg·L-1）相差11.24%，這表明二次多項(xiàng)式逐步回歸分析法所建立的模型不能很好反映出因子與響應(yīng)值的非線性關(guān)系。

2.3.2偏最小二乘二次回歸分析

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項(xiàng)）、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項(xiàng)）分析得出不同的優(yōu)化方案，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　培養(yǎng)基不同優(yōu)化方案對(duì)輔酶Q10發(fā)酵的影響

由表3可知，偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項(xiàng)）、偏最小二乘二次回歸（考交換項(xiàng)）的實(shí)驗(yàn)值相差不大，但是后兩者的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值偏差要大于前者。這表明，上述4個(gè)因子濃度與輔酶Q10濃度呈二次曲線關(guān)系，同時(shí)各因子間的交換作用不可忽略。如果在偏最小二乘二次回歸分析中，只考慮各因子的平方項(xiàng)或各因子間的互作項(xiàng)時(shí)，則分析預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值都有較大的偏差。所以將偏最小二乘二次回歸分析方案作為輔酶Q10發(fā)酵培養(yǎng)基最佳優(yōu)化方案：葡萄糖38 g·L-1、玉米漿粉7.0 g·L-1、硫酸銨3.5g·L-1、味精 7.2 g·L-1。該優(yōu)化方案下的輔酶 Q10濃度為 230.71 mg·L-1，比優(yōu)化前（150 mg·L-1）提高了53.81%。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先采用單因子實(shí)驗(yàn)，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重要成分的適宜濃度范圍，再采用均勻設(shè)計(jì)對(duì)重要因子進(jìn)行優(yōu)化組合，分別進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸、偏最小二乘二次回歸、偏最小二乘二次回歸（考慮交換項(xiàng)）、偏最小二乘二次回歸（考慮平方項(xiàng)）分析。結(jié)果表明，各因子的平方項(xiàng)和各因子間的互作項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值都具有影響作用。偏最小二乘二次回歸分析的模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值偏差最小，其優(yōu)化方案使輔酶 Q10濃度得到明顯提高。

參考文獻(xiàn)：

[1] Jeya M, Moon H-J, Lee J-L, et al. Current state of coenzyme Q10 production and its applications[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2010, 85(6):1653-1663.

[2] Kettawan A, Kunthida C, Okuno M, et al. Protective effects of coenzyme Q10 against oxidative stress induced by aerobic exercise[J]. Institute of Nutrition, 2012(44):1-2.

[3] 陶志杰，王改玲，李妍. 輔酶 Q10的制備及應(yīng)用新進(jìn)展[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2010, 31(9):9-11.

[4] 鄭毅，王婭, 朱志春，等. 發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶 Q10研究進(jìn)展[J]. 海峽科學(xué), 2012(8):128-130.

[5] 于子玲，袁亞宏，岳田利，等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化輔酶 Q10產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(18):186-189.

[6] 邵玲莉,石玲玲. 輔酶 Q10產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 生物加工過(guò)程, 2010, 8(2):18-22.

[7] 唐良華，夏黎明，蘇敏. Bacillus sp. ZJU318 脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 科技通報(bào), 2006, 22(5):622-626.

[8] 吳祖芳，堵國(guó)成，陳堅(jiān). 發(fā)酵液中輔酶 Q10的分離純化和定量分析[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 21(4):420-423.

[9] 朱志春，鄭毅，朱中南，等. 超聲波破碎法提取輔酶 Q10研究[J]. 海峽科學(xué), 2012(2):17-19.

[10] 朱志春. 基因組改組選育類(lèi)球紅細(xì)菌輔酶Q10高產(chǎn)菌株[D]. 福州：福建師范大學(xué)，2012.

* 福建省自然基金資助，項(xiàng)目編號(hào)：2015J01127。