李文靜　程冬梅　崔占琴　陳惠珍

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·論著·

17β-雌二醇對人牙髓細胞增殖影響的體外研究

李文靜程冬梅崔占琴陳惠珍

050000石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院口腔內(nèi)科(李文靜、程冬梅、陳惠珍)，口腔正畸科(崔占琴)

【摘要】目的觀察不同濃度17β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙髓細胞增殖的影響。方法選取年輕恒牙，采用組織塊酶消化法獲取人牙髓細胞并進行原代培養(yǎng)。取第4代對數(shù)生長期人牙髓細胞SABC法進行波形蛋白和角蛋白免疫組化染色鑒定細胞來源。將處于對數(shù)生長期的第4代人牙髓細胞隨機分為5個實驗組、1個對照組和1個空白對照組，96孔培養(yǎng)板每組選6個孔。實驗組：在有細胞孔內(nèi)分別加入含2%活性碳吸附胎牛血清的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)液配置的終末濃度為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的17β-雌二醇。對照組：在有細胞孔內(nèi)僅加入培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M：在無細胞孔內(nèi)僅加入培養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)48 h和72 h時用MTT 比色法檢測17β-雌二醇對人牙髓細胞增殖的影響。采用流式細胞術(shù)檢測各濃度組17β-雌二醇對人牙髓細胞的細胞周期的影響。結(jié)果與對照組比較，在一定濃度范圍內(nèi)17β-雌二醇能促進人牙髓細胞的增殖和細胞周期進程，以10-8mol/L的17β-雌二醇作用最為明顯(P<0.05)。結(jié)論17β-雌二醇對人牙髓細胞細胞增殖有一定的誘導作用。

【關(guān)鍵詞】人牙髓細胞；17β-雌二醇；增殖；細胞周期；流式細胞術(shù)

牙髓的生活狀態(tài)與牙齒的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝和抵御外來有害刺激的能力息息相關(guān)[1-3]。通過增強牙髓細胞的增殖活性推進細胞周期進程等途徑更好的進行活髓保存治療，已成為當前牙體牙髓病學研究的重點。17β-雌二醇是動物機體內(nèi)產(chǎn)生的一種具有廣泛而高效生物活性的類固醇化合物，它可以通過調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡等生物學特性來影響和調(diào)節(jié)機體的生理活動[4，5]，但其作用范疇和相應作用機制還未明確。故本實驗著力于研究不同濃度17β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙髓細胞的生物學特性影響。旨在初步探討17β-雌二醇對牙髓細胞生物學特性的影響及作為一種新型誘導劑應用于人牙髓細胞組織工程領(lǐng)域的可行性，并為其將來應用于臨床提供實驗學依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料與儀器實驗材料：17β-雌二醇(美國Sigma,產(chǎn)品貨號E8875)，標準型胎牛血清(杭州四季青,產(chǎn)品貨號121005)，活性碳吸附胎牛血清(美國Sigma,產(chǎn)品貨號04-201-1A)，高糖DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco,產(chǎn)品貨號sh30022.01)，無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)液(美國Sigma,產(chǎn)品貨號A3137-1000)，青霉素、鏈霉素(華北制藥)，Ⅰ型膠原酶(美國Sigma,產(chǎn)品貨號13820)，胰蛋白酶(美國Sigma,產(chǎn)品貨號t1300-100)，波形絲蛋白 (北京中山生物技術(shù)有限公司)，角蛋白 (北京中山生物技術(shù)有限公司)，即用型SABC試劑盒(博士德公司)，噻唑鹽(MTT)(美國Sigma)，二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma)。實驗儀器：CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus)，超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，倒置相差顯微鏡(德國Leica)，酶聯(lián)免役檢測儀(Finland Labsystems dragon MK3)，6孔培養(yǎng)板 (美國Gibco)，25 ml塑料培養(yǎng)瓶(美國Gibco)，96 孔培養(yǎng)板(美國Gibco)。

1.2實驗方法

1.2.1人牙髓細胞的原代培養(yǎng)及細胞傳代:選取因正畸或阻生新鮮拔除的健康、完整、無齲、無隱裂年輕恒牙(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院口腔外科提供)。用牙科專用裂鉆于牙頸部環(huán)形磨一深溝(不可露髓)。然后將牙齒放入盛有高糖DMEM培養(yǎng)液的無菌小瓶中并置入放有冰袋的保溫桶內(nèi)迅即進入實驗室。嚴格無菌條件下于超凈工作臺內(nèi)用技工剪沿牙頸部深溝剪斷牙齒，獲取牙髓，棄根尖部位2 mm的牙髓組織，將剩余牙髓組織剪成大小約0.5～1 mm的組織碎塊置于離心管內(nèi)，并加入約1.5 ml的Ⅰ型膠原酶于37℃、5%CO2、飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育70 min后取出，離心5 min。棄上清液，收集細胞與組織碎塊移入6孔板，加少量含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，次日加足培養(yǎng)液，每3天換液1次。當細胞鋪滿孔底80%后，以0.25%胰酶消化，按1∶1首次傳代，以后按1∶2或1∶3傳代。選用性能穩(wěn)定、細胞單一的第4代或第5代培養(yǎng)的細胞用于實驗。

1.2.2細胞來源鑒定及形態(tài)學觀察:取第4代對數(shù)生長期人牙髓細胞爬片，用SABC法進行波形蛋白和角蛋白免疫組化染色鑒定細胞來源；用HE染色法顯現(xiàn)細胞形態(tài)，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3配制目的濃度細胞懸液及藥物:原液的細胞濃度計算：取少量細胞懸液滴入細胞計數(shù)盤，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計算4個大格內(nèi)的細胞總數(shù)，根據(jù)公式(細胞數(shù)/4)×104cells/ml計算出細胞原液的細胞濃度。稀釋倍數(shù)的計算：本實驗的目的濃度為1×104cells/ml，根據(jù)公式：稀釋倍數(shù)=原液濃度/目的濃度。目的濃度細胞懸液的配制：本實驗需要細胞懸液的目的量為10 ml，根據(jù)公式：所需原液的量(X ml)=目的量/稀釋倍數(shù)。然后取細胞原液X ml放入滅菌后的15 ml離心管內(nèi)，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(10-X)ml配成目的濃度的細胞懸液10 ml。目標濃度的藥物配制：17β-雌二醇的分子量是272.38，可將0.0272 g的17β-雌二醇用10 ml的無水乙醇溶解配制成10～2 mol/L儲存液，-20℃冰箱保存。使用時，用2%活性碳吸附胎牛血清的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)液將儲存液稀釋成終末濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的17β-雌二醇，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實驗分組并加藥:將處于對數(shù)生長期的第4代人牙髓細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，制成細胞懸液，以1×104個/ml分別接種于五個96孔培養(yǎng)板，每孔液量200 μl，每板余出一列培養(yǎng)孔不做任何處理，培養(yǎng)24 h。觀察細胞貼壁情況良好后，棄上清液，PBS緩沖液清洗3次，吸干，將細胞隨機分為5個實驗組、1個對照組與1個空白對照組，每組6孔。連續(xù)培養(yǎng),每天換液以維持藥物濃度恒定。實驗組：在相應的有細胞孔內(nèi)加入150 μl終末濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的17β-雌二醇。對照組：在相應的有細胞孔內(nèi)僅加入150 μl含2 %活性碳吸附胎牛血清的無酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)?？瞻讓φ战M：在相應的無細胞孔內(nèi)加入150 μl含2%活性碳吸附胎牛血清的無酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.5細胞增殖及細胞周期的測定

1.2.5.1MTT比色法檢測17β-雌二醇對人牙髓細胞增殖的影響：分別于培養(yǎng)48 h和72 h時隨機取出1個96孔培養(yǎng)板，向所測孔內(nèi)加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5 min，以空白對照孔調(diào)零，在酶標儀上測定492 nm下各孔的吸光度值。

1.2.5.2流式細胞術(shù)檢測17β-雌二醇對人牙髓細胞細胞周期的影響：選用10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L 的17β-雌二醇作為試驗組，與對照組(未加藥物組)進行細胞周期測定。將第4代細胞以5×104個/ml濃度傳入細胞瓶中，每個濃度復種3瓶，培養(yǎng)24 h觀察到細胞貼壁良好后，對照組和各實驗組分別加入相應培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后棄液，用0.25%胰酶消化并分別收集各組細胞,離心棄上清后加入預冷(-20℃)70%酒精1 ml，震蕩混勻，4℃固定過夜。上機檢測前將各樣本離心(800 r/min，5 min)，去除乙醇，PBS液清洗2次，去上清重懸細胞于含100 unit/ml RNaseA的PBS緩沖液中，避光37℃孵育30 min，加2 mg/ml PI至終濃度50 g/ml，避光染色30 min。用流式細胞儀在氬激光光源，功率250 mW，激發(fā)波長為488 nm，接收波長為590～630 nrn，變異系數(shù)小于2%的測試條件下進行測試，聯(lián)機專用軟件分析處理，計算出各細胞周期時相細胞的比例。

2結(jié)果

2.1人牙髓細胞的原代培養(yǎng)及細胞傳代牙髓組織塊經(jīng)消化后解離為直徑約0.1～0.5 mm的組織碎塊，且大多數(shù)能順利貼壁。培養(yǎng)3～8 d，倒置顯微鏡下可見細胞以貼附組織塊為中心呈放射狀排列生長,細胞呈長梭形或星形，胞漿豐富，核仁清晰呈圓形。12～15 d 左右細胞覆蓋孔底達80%，呈旋渦狀排列，可首次傳代。傳代后細胞生長旺盛，狀態(tài)良好，3代后呈均一的長梭形細胞。見圖1、2。

圖1細胞以貼附組織塊為中心呈放射狀排列生長，細胞呈長梭形成星形(倒置顯微鏡×100)

圖2　均一的長梭形細胞呈旋渦狀排列(倒置顯微鏡×100)

2.2細胞來源鑒定及形態(tài)學觀察免疫細胞化學染色結(jié)果顯示人牙髓細胞波形蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)可見棕黃色著色顆粒，細胞胞核復染為藍色；角蛋白染色陰性，胞漿內(nèi)無著色顆粒，證實細胞為來自中胚層間充質(zhì)細胞，無上皮細胞混雜。細胞形態(tài)學觀察：HE染色可見細胞胞漿呈均勻的粉紅色，胞核圓形呈藍紫色，可見一個或多個清晰而深染的核仁，胞體豐滿，伸展佳。見圖3～5。

2.317β-雌二醇對人牙髓細胞增殖的影響加入顯色劑后各孔內(nèi)液體呈現(xiàn)深淺不一的藍紫色，在酶標儀上測定492 nm下各孔的吸光度值。本實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的17β-雌二醇在第48小時、72小時的MTT光密度值之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且濃度為10-8mol/L時差異最為顯著(P<0.05)；10-5mol/L的17β-雌二醇

圖3 人牙髓細胞波形蛋白染色陽性(×200)圖4 人牙髓細胞角蛋白染色陰性(×100)圖5 人牙髓細胞HE染色(×200)

與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明10-6、10-7、10-8、10-9mol/L這4種濃度組的17β-雌二醇對于體外培養(yǎng)的人牙髓細胞具有促進增殖的作用，其中以10-8mol/L濃度的促增殖作用最為明顯，10-5mol/L濃度藥物無促進細胞增殖的作用。見表1。

2.417β-雌二醇對人牙髓細胞細胞周期的影響各實驗組與對照組比較DNA合成前期(G1)細胞所占百分比均有所減少，而DNA合成期(S)細胞所占百分比均有所增多，反映細胞增殖活力的PrI增殖指數(shù)[即(S+G2M)]也明顯升高，其中10-8mol/L 17β-雌二醇濃

表1　17β-雌二醇對人牙髓細胞增殖的影響　±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與10-8比較，#P<0.05

度組作用最明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　17β-雌二醇對人牙髓細胞周期的影響　±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與10-8比較，#P<0.05

3討論

牙髓組織在體內(nèi)被堅硬的牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)所包圍，其生活狀態(tài)與牙齒的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝和抵御外來有害刺激的能力息息相關(guān)[1-3]。牙髓細胞是牙髓組織中的主要功能細胞，其成分包括成纖維細胞、成牙本質(zhì)細胞、未分化的間充質(zhì)細胞和組織細胞[6,7]。當牙髓受到外界刺激時，成纖維細胞會分化為成牙本質(zhì)細胞，進而形成修復性牙本質(zhì)。這些新生的修復性牙本質(zhì)礦化后將作為一道有力的屏障來保護牙髓組織，進而起到保存牙齒活力的作用。故牙髓細胞的增殖活性、分化潛能及礦化能力在牙髓創(chuàng)傷修復機制中的作用非常重要。本實驗從原代培養(yǎng)人牙髓細胞入手，觀察并探討17β-雌二醇對其增殖活性和細胞周期的體外誘導作用。

3.117β-雌二醇的藥理作用及藥物選擇依據(jù)17β-雌二醇是動物機體內(nèi)產(chǎn)生的一種具有廣泛而高效生物活性的類固醇化合物，通過調(diào)節(jié)各種組織細胞的代謝活動來影響和調(diào)節(jié)機體的生理活動。它與位于細胞內(nèi)的雌激素受體結(jié)合后，致使雌激素受體構(gòu)型發(fā)生改變，并在輔助調(diào)節(jié)因子的作用下與胞核內(nèi)靶基因上游啟動子區(qū)域的雌激素反應元件(ERE)結(jié)合，從而直接激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，或與其他轉(zhuǎn)錄因子作用間接誘導靶基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及合成蛋白質(zhì)[8]，影響細胞的分裂、繁殖和生長，最終表現(xiàn)為不同強度的雌激素樣效應或抗雌激素效應。

張秀珍等[9,10]通過實驗研究得出結(jié)論：17β-雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)促進體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞的增殖和分化。同時，他們還發(fā)現(xiàn)此促進作用的產(chǎn)生與17β-雌二醇能夠激活p38MAPK有關(guān)。大量研究也已證明17 β-雌二醇作為一種代表性的雌激素，是體外誘導成骨細胞增殖、分化和促進鈣鹽沉積的重要因子，是絕大部分種屬骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化過程中所必需的[11-14]。有研究表明牙髓細胞與成骨細胞有十分相似的性質(zhì)[15]，因此本實驗即選用含2%活性碳吸附胎牛血清的無酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)液配制的濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的17β-雌二醇用于實驗。借用成骨細胞的研究經(jīng)驗，研究不同濃度的17β-雌二醇對體外培養(yǎng)的人牙髓細胞生物學特性的作用影響，為其將來應用于臨床中的牙髓創(chuàng)傷修復提供實驗依據(jù)。

3.217β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙髓細胞生物學特性的影響

3.2.117β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙髓細胞增殖活性的影響:本實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，10-6、10-7、10-8、10-9mol/L的17β-雌二醇在第48小時、72小時的MTT光密度值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，濃度為10-8mol/L時差異最為顯著(P<0.05)；10-5mol/L 的17β-雌二醇與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明10-6、10-7、10-8、10-9mol/L這4種濃度的17β-雌二醇對體外培養(yǎng)的人牙髓細胞具有促進增殖的作用，其中以10-8mol/L濃度的促增殖作用最為明顯，10-5mol/L濃度藥物無促進細胞增殖的作用，這可能是由于藥物高濃度時可能會對細胞產(chǎn)生一定的細胞毒性，從而體現(xiàn)不出對細胞分裂增殖的促進作用。該實驗結(jié)果提示17β-雌二醇促進人牙髓細胞增殖活性的有效藥物濃度在10-6mol/L之內(nèi)，其中濃度為10-8mmol/L時促增殖作用最佳。根據(jù)Zou等[16]關(guān)于17β-雌二醇對宮頸癌HeLa細胞增殖促進作用的研究結(jié)果推斷，17β-雌二醇可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期和細胞內(nèi)Ca2+濃度水平，從而調(diào)節(jié)牙髓細胞的增殖活動的。另外，國內(nèi)學者的大量研究顯示17β-雌二醇還可以通過與細胞內(nèi)不同種類的雌激素受體結(jié)合來調(diào)節(jié)細胞的增殖水平[17,18]。具體本實驗中17β-雌二醇促進體外培養(yǎng)人牙髓細胞增殖的作用機制，有待今后進一步研究探討。

3.2.217β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙髓細胞細胞周期的影響:細胞的增殖是通過有絲分裂的過程實現(xiàn)的，每次有絲分裂所經(jīng)歷的整個過程被稱為細胞周期，細胞周期的順利進行是細胞增殖的前提條件[19，20]。每個細胞周期可分為間期(包括G1、S和G2期)和分裂期(M期)，處于不同期細胞的比例可大致反映細胞群體的增殖活性。 G1期為DNA合成前期，是細胞為S期的DNA合成做準備的階段，一般增殖旺盛的細胞能及時從G1期進入S期，表現(xiàn)為G1期持續(xù)時間短、細胞比例少；S期即DNA合成期，一般處于增殖旺盛階段的細胞在此期細胞比例較高，持續(xù)時間較長；G2期為細胞分裂前期，M期為細胞有絲分裂期，通過公式PrI=S+ G2M可計算得到細胞的增殖指數(shù)PrI，該指數(shù)代表了群體中增殖期細胞的數(shù)量，可以很好的反應出細胞的增殖狀態(tài)[21]。

本實驗采用流式細胞儀檢測技術(shù)觀察17β-雌二醇對體外培養(yǎng)人牙髓細胞周期的影響。結(jié)果顯示：17β-雌二醇能夠改變體外培養(yǎng)人牙髓細胞周期中各期細胞所占的百分比，且各實驗組牙髓細胞中S期DNA的含量均較對照組有所提高，其中以10-8mol/L時作用最為明顯，表現(xiàn)為DNA合成前期(G1期)細胞比例明顯下降，而DNA合成期(S期)細胞比例及增殖指數(shù)[PrI(S+G2M)%]明顯升高。提示：本實驗所選用的17β-雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)具有推進人牙髓細胞細胞周期進程、促進其分裂增殖及DNA合成的作用。

本實驗結(jié)果提示，17β-雌二醇在一定濃度范圍內(nèi)具有推進人牙髓細胞細胞周期進程、促進其分裂增殖及DNA合成的作用。其作用機制是否與17β-雌二醇調(diào)控人牙髓細胞的cdc、CDKs及cyclin的改變有關(guān)以及具體是通過一起調(diào)控這三個關(guān)鍵因子還是通過調(diào)控其中的某一個或兩個來發(fā)揮作用及其詳細的調(diào)控機制還有待進一步的研究。

采用組織塊酶解法可成功培養(yǎng)出人牙髓細胞，培養(yǎng)所得細胞生長旺盛，形態(tài)呈均一的成纖維細胞樣，可復層生長，符合實驗要求。17β-雌二醇能促進人牙髓細胞的增殖和細胞周期進程，對人牙髓細胞體外增殖有一定的誘導作用。其中，17β-雌二醇濃度在10-8mol/L時是促進人牙髓細胞增殖的最佳作用濃度。

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Influence of 17β-E2 on biological behavior of HDPCs cultured in vitro

LIWenjing*,CHENGDongmei*,CUIZhanqin,etal.

*DepartmentofStomatology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of 17 beta estradiol (17β-E2) on proliferation activity, alkaline phosphates’(ALP) activity, the cell cycle of human dental pulp cells(HDPCs) in vitro. MethodsThe dental pulp tissue was taken from healthy young people' molars or premolar,then the dental pulp cells were obtained by tissue explant-collagenase digestion method and cultured in vitro. The fourth generation dental pulp cells were identified by vimentin and keratin immunohistochemisty staining for cell origin. The fourth generation dental pulp cells at logarithmic phase were digested and made into cell suspension with 0.25% trypsin,and the cell suspension was placed into 96-well microplates, then the HDPCs at logarithmic phase were randomly divided into 5 experimental groups,1 control group and 1 blank control group,with 6 holes in each group. The experimental groups: 17 beta estradiol 150μl with terminal concentration being 10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L,respectively was added into corresponding cell holes,and 17 beta estradiol was placed into phenol red free high sugar DMEM medium containing 2% activated carbon adsorption fetal calf serum. The control group: only DMEM nutrient solution was added into corresponding cell holes. The blank control group: DMEM nutrient solution was added into corresponding holes without cells. The effects of 17β-E2 on the proliferation of HDPCs were detected by MTT at 48h,72h, respectively.The effects of 17β-E2 on the cell cycle of HDPCs were detected by flow cytometry.ResultsIn contrast with control group, 17β-E2 could promote proliferation of HDPCs and cell cycle process within a certain range of concentration. The effects of 17β-E2 in concentration of 10-8mol/L were the most significant (P<0.05).ConclusionThe 17β-E2 can induce proliferation of HDPCs at some extent in vitro.

【Key words】human dental pulp cells;17 beta estradiol;proliferation activity;cell cycle; flow cytometry

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.13.002

通訊作者:陳惠珍，050000石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院口腔內(nèi)科;

【中圖分類號】R 329.441

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)13-1929-05

(收稿日期：2016-01-15)

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