褚德雅　劉森　朱名毅　彭麗雲(yún)　劉津　高潔　盧露碧

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·論著·

人鼻咽癌耐藥裸鼠移植瘤模型的建立及耐藥性檢測

褚德雅劉森朱名毅彭麗雲(yún)劉津高潔盧露碧

533000廣西壯族自治區(qū)百色市，右江民族醫(yī)學院附屬臨床學院(褚德雅、劉森、彭麗雲(yún)、劉津)；右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院(朱名毅、高潔、盧露碧)

【摘要】目的優(yōu)化建立人鼻咽癌CNE-1/順鉑耐藥裸鼠移植瘤模型的方法，并檢測其藥耐藥性，為后續(xù)鼻咽癌的耐藥機制研究奠定基礎。方法采用順鉑誘導鼻咽癌CNE-1細胞，建立其多藥耐藥細胞株CNE-1/順鉑細胞；將3個不同濃度的耐藥細胞分別接種于裸鼠皮下，觀察其成瘤性及轉移情況；蛋白印跡法檢測LRP、VEGF、Bcl-2在CNE-1細胞、CNE-1/順鉑耐藥細胞和移植瘤的表達情況。結果經(jīng)順鉑誘導建立了鼻咽癌CNE-1/順鉑耐藥細胞株；其對順鉑、長春新堿和紫杉醇的耐藥性分別增加35.83、23.74和10.54倍。5×106/ml的耐藥細胞成瘤率為83.33%，其他2個濃度耐藥細胞未見成瘤，所有裸鼠均未見肝、肺等器官出現(xiàn)轉移瘤。LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在耐藥細胞和移植瘤中的表達均高于CNE-1細胞(P<0.05)。結論CNE-1/順鉑耐藥細胞的成瘤性與細胞濃度有關，CNE-1耐藥細胞移植瘤依然保持很好的耐藥性，可為鼻咽癌耐藥逆轉劑的研究提供較理想的動物模型。

【關鍵詞】鼻咽腫瘤；耐藥性；移植瘤

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)為華南各省最常見的惡性腫瘤之一，以早期淋巴道轉移為特征，鼻咽癌耐藥的出現(xiàn)，極大降低了臨床治療效果[1]。為了深入研究鼻咽癌耐藥的生物學行為特征，需要建立鼻咽癌耐藥動物模型。目前，在裸鼠中建立腫瘤模型是研究腫瘤生物學特性的基本手段[2]，但在BALB/c裸鼠上建立鼻咽癌耐藥移植瘤并對移植方法及移植瘤的生長特性進行觀察和研究，目前筆者尚未見相關報道。因此，我們擬利用鼻咽癌CNE-1/順鉑耐藥細胞株建立鼻咽癌耐藥移植瘤模型，初步觀察移植瘤的耐藥特征。

1材料與方法

1.1材料人鼻癌細胞株CNE-1購自中國科學院上海細胞生物研究所，由右江民族醫(yī)學院科學實驗中心保存。BALB/c裸鼠18只，8周齡，雄性18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，在右江民族醫(yī)學院SPF級動物房飼養(yǎng)。PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、順鉑和四甲基偶氮唑鹽購自美國Sigma公司，MRP、VEGF和Bcl-2抗體及相關蛋白印跡試劑購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1人鼻咽癌CNE-1/順鉑耐藥細胞株的建立：參照文獻[3]采用逐步增加順鉑濃度的方法建立人鼻咽癌CNE-1/順鉑耐藥細胞株，選擇對數(shù)生長期的CNE-1細胞，用含有順鉑的培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，順鉑初始濃度為0.05 μg/ml，按0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml逐步將濃度增加，直至細胞不能耐受為止，細胞要在每個濃度中穩(wěn)定生長并傳代3次。 經(jīng)過2個月觀察和實驗，確定1.0 μg/ml為CNE-1細胞的極限耐受濃度，細胞生長穩(wěn)定，經(jīng)1.0 μg/ml篩選傳代5次后，誘導出鼻咽癌CNE-1/順鉑耐藥細胞株，用于后續(xù)實驗。

1.2.2MTT法檢測耐藥性：MTT法檢測CNE-1和CNE-1/順鉑耐藥細胞對順鉑、長春新堿、紫杉醇的耐藥性，具體實驗步驟按照說明書操作。1×104個/ml 細胞接種于96孔板，24 h后更換含有序列稀釋化療藥(順鉑、長春新堿或紫杉醇)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)68 h，每孔加入10 mg/ml的MTT溶液 20 μl，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除舊培養(yǎng)液，每孔再加入DMSO 200 μl，輕微振蕩5 min使溶解結晶。檢測波長為570 nm，用酶標儀進行OD值檢測，根據(jù)Bliss法計算IC50值。耐藥指數(shù)(RI)=(CNE-1細胞IC50)/(CNE-1/順鉑耐藥細胞IC50)。

1.2.3裸鼠人鼻咽癌CNE-1/順鉑移植瘤模型的建立及觀察轉移情況：取裸鼠18只，隨機分為3組，低濃度組(5×104個/ml)、中濃度組(5×105個/ml)和高濃度組(5×106個/ml)。取對數(shù)生長期的耐藥細胞，按分組要求分別接種0.2 ml細胞于BALB/c裸鼠右側腋窩皮下。每日觀察腫瘤生長情況及裸鼠生活習性，連續(xù)觀察8周。8周后頸椎脫臼處死裸鼠，解剖取腫瘤，用精密游尺測量腫瘤體積，腫瘤體積計算公式：V=ab2/2，V為體積，a為長徑，b為橫徑。1/2腫瘤組織甲醛固定，石蠟包埋，做病理切片及HE染色，另1/2組織-80℃凍存用于后續(xù)的蛋白印跡實驗。解剖胸腔和腹腔觀察肝、肺等臟器的腫瘤轉移情況。同時取部分肺和肝臟組織進行病理切片及HE染色。

1.2.4蛋白印跡法檢測LRP、VEGF和Bcl-2的表達情況：CNE-1細胞株、CNE-1/順鉑耐藥細胞株和腫瘤組織按照試劑說明書的具體步驟進行蛋白提取，分光光度計測總蛋白濃度，上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度。15%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再電轉移到PVDF膜，37℃下用10%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入相應一抗，4℃冰箱孵育過夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL曝光、顯影，以β-actin為內(nèi)參。將膠片掃描后，用Image Pro Plus7.0軟件測量目的蛋白及其內(nèi)參β-actin的吸光度值，目的蛋白的相對表達量為目的蛋白吸光度值/內(nèi)參β-actin蛋白吸光度值。

2結果

2.1CNE-1細胞和CNE-1/順鉑細胞的耐藥性檢測與CNE-1細胞相比，CNE-1/順鉑耐藥細胞的IC50值均有顯著增加(P<0.05)，即CNE-1/順鉑細胞對順鉑、長春新堿、紫杉醇的耐藥分別是CNE-1細胞的35.83、23.74和10.54倍。見表1。

表1不同藥物在CNE和CNE/DDP中的IC50值及耐藥指數(shù)

化療藥物IC50(μg/ml)CNE-1CNE-1/順鉑耐藥指數(shù)(RI)順鉑0.982±0.08135.186±1.403*35.83長春新堿0.062±0.0081.472±0.146*23.74紫杉醇0.098±0.0121.033±0.119*10.54

注：與CNE-1比較，*P<0.05

2.2CNE-1/順鉑耐藥細胞的成瘤性及轉移情況3組裸鼠接種耐藥細胞后，其中5×106/ml組有5只裸鼠成瘤，成瘤率為83.33%，其他組裸鼠則未見成瘤，所有裸鼠荷瘤期間生活習性和飲食無明顯變化。取材時，腫瘤重量為(1.02±0.23)g，大小為(0.416±0.125)cm3，腫瘤均未發(fā)生破潰壞死。移植瘤組織HE染色見：腫瘤細胞分化差，以大圓細胞為主，形成癌巢，細胞質較豐富、淡染，核仁大小不一，組織間可見少量新生血管。肝臟和肺組織的病理切片未見腫瘤轉移灶。見圖1。

2.3蛋白印跡檢測LRP、VEGF和Bcl-2蛋白的表達情況Western blot實驗結果顯示：LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1/DDP細胞和移植瘤中的表達均明顯高于CNE-1細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；LRP、VEGF和Bcl-2在CNE-1/順鉑細胞株和移植瘤比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖2。

裸鼠移植瘤組織(HE×200)裸鼠肝臟組織(HE×100)裸鼠肺組織(HE×100)

圖1裸鼠移植瘤、肝和肺的病理切片

表2LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1細胞、CNE-1/順鉑細胞和移植瘤中的表達

類別LRPVEGFBcl-2CNE-1細胞0.14±0.030.30±0.050.17±0.05CNE-1/順鉑細胞0.47±0.07*1.08±0.12*0.59±0.08*移植瘤0.48±0.09*#1.06±0.15*0.62±0.10*

注：與CNE-1細胞比較，*P<0.05

圖2LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1細胞、CNE-1/順鉑細胞和移植瘤中的表達

3討論

低分化鱗癌是我國鼻咽癌最常見的病理類型，其對化療比較敏感，但是對于中晚期鼻咽癌則需要化療結合放療[4]。鼻咽癌化療的藥物主要有鉑類、植物生物堿類、烷化劑類和抗代謝類等。目前治療鼻咽癌最常用的藥物是順鉑，其作用機制是能與DNA鏈產(chǎn)生交叉聯(lián)結，從而抑制DNA的正常功能，而且，其還具有增加放療的作用[5]。但是近幾年，臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)患者使用順鉑化療藥物一段時間后，會出現(xiàn)耐藥而影響化療效果[6]。因此目前鼻咽癌研究的重點之一是如何降低鼻咽癌細胞對各種化療藥物的耐藥性，增強其對化療藥物的敏感性。

腫瘤體內(nèi)研究中不可缺少的手段是在動物身上復制人類腫瘤，建立人類鼻咽癌鼠移植瘤模型是目前研究鼻咽癌的病因學、發(fā)病學及治療的理想實驗模型。在早期的實驗中，我們建立了人鼻咽癌鉑耐藥細胞株(Tw03/DDP)，并對其耐藥機制進行了體外的細胞學研究，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌對順鉑獲得性耐藥具有多藥耐藥性的特點，可以顯著增加紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素和長春新堿的耐藥指數(shù)，其耐藥性的產(chǎn)生可能與肺耐藥蛋白(lung resistance protein，LRP)的高表達有關[3]。我們在CNE-1/順鉑耐藥細胞株也發(fā)現(xiàn)其有同樣的多藥耐藥特性，CNE-1/順鉑耐藥細胞對順鉑、長春新堿和紫杉醇的耐藥分別增加了35.83、23.74和10.54倍，同樣LRP蛋白的表達也增加了2.98倍。這些實驗結果說明，耐藥細胞的產(chǎn)生會明顯降低化療藥物的臨床治療效果，其具體機制可能與耐藥蛋白的形成有關。LRP是常見的耐藥蛋白之一，其主要通過胞吐或囊泡轉運機制將細胞內(nèi)的化療藥物排到細胞外，從而降低細胞內(nèi)的藥物濃度，導致化療作用降低[7]。有學者發(fā)現(xiàn)多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、LRP在大腸癌中均有不同程度的高表達，而且MRP與LRP的表達呈正相關[8]。

雖然，在裸鼠中建立腫瘤模型的文獻很多，但鮮有文獻報道腫瘤細胞濃度與移植瘤生長特性的研究和觀察。我們將3種不同濃度的耐藥細胞注射到裸鼠腋窩，結果發(fā)現(xiàn)成瘤的難易與腫瘤細胞濃度成正相關，只有濃度為5×106/ml組中有5只裸鼠成瘤。究其原因，BALB/c裸鼠雖T細胞免疫缺陷，但有B淋巴細胞介導的體液免疫，皮下接種的耐藥細胞過少，易被裸鼠的體液免疫清除[9]。因此，我們認為5×106個/ml的腫瘤細胞皮下接種是較為理想的，此濃度腫瘤細胞致瘤成功率高，且潛伏時間較短。

腫瘤細胞的凋亡決定著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而新生的血管為腫瘤生長提供了營養(yǎng)[10，11]。Bcl-2基因是原癌基因之一，它能夠抑制腫瘤細胞的凋亡，Bcl-2表達上調(diào)與腫瘤細胞的耐藥有密切關系[12，13]。在人腦膠質瘤細胞AM38中抑制miR-16后，可以上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，進而增加膠質瘤細胞AM38對化療藥替莫唑胺的敏感性[14]。VEGF是血管形成調(diào)控分子，具有促進血管形成的作用，不少文獻報道腫瘤細胞耐藥的新機制與VEGF表達增加有關[15]。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1/順鉑耐藥細胞和移植瘤中的表達均高于CNE-1細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這些結果說明，腫瘤細胞的耐藥性在移植瘤中得到繼續(xù)保留，所以用耐藥細胞來建立耐藥移植瘤是可行的，為進一步體內(nèi)研究耐藥性提供很好的實驗動物載體。腫瘤細胞形成耐藥性后，Bcl-2蛋白表達增加，從而導致腫瘤細胞的凋亡數(shù)量減少，使得腫瘤不斷增長。有研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控作用抑制Bcl-2蛋白的表達，可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[16]。同樣，我們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞耐藥性形成的同時，會增加其VEGF蛋白的表達，但具體機制不詳。有學者認為在耐藥過程中高表達的LRP、VEGF和Bcl-2也能促進腫瘤細胞的耐藥性，也就說它們是相互促進，惡性循環(huán)的[17]。目前研究發(fā)現(xiàn)LRP高表達可能與腫瘤中VEGF基因表達上調(diào)及VEGF促進腫瘤血管生成增加有關，而抑制腫瘤新生血管的生成可以降低腫瘤細胞對化療的耐藥性[18]。

綜上所述，本研究通過建立裸鼠耐藥移植瘤的實驗，發(fā)現(xiàn)一定濃度的耐藥細胞才能在裸鼠皮下生成移植瘤。CNE-1/順鉑耐藥細胞及其移植瘤中LRP、VEGF和Bcl-2蛋白的表達顯著高于CNE-1細胞，耐藥細胞形成的移植瘤依然保留其耐藥特性。這些研究結果為深入闡明鼻咽癌細胞的耐藥機制，發(fā)現(xiàn)耐藥逆轉分子及其作用機制，進一步指導鼻咽癌的綜合治療提供了實驗依據(jù)。

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Establishment of drug resistance transplanted tumor models in nude mice with human nasopharyngeal carcinoma CNE-1/DDP and drug resistance detection

CHUDeya*,LIUSen*,ZHUMingyi,etal.

*AffiliatedHospitalofYoujiangNationalityMedicalUniversity,Guangxi,Baise533000,China

【Abstract】ObjectiveTo look for optimized methods to establish drug resistance transplanted tumor models in nude mice with human nasopharyngeal carcinoma CNE-1/DDP (cisplatin), and to detect its drug resistance in order to set up the foundation for the follow-up researches about the mechanism of drug resistance of nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsThe multidrug resistant cell line CNE-1/DDP cells were established by cisplatin induction,then the three different concentrations of drug-resistant cells were inoculated subcutaneously into nude mice, respectively, and to observe the tumorigenicity and metastasis,The expression levels of LRP,VEGF and Bcl-2 in CNE-1 cells, CNE-1/DDP resistant cells and transplanted tumor were detected by Western Blotting.ResultsThe nasopharyngeal carcinoma CNE-1/DDP resistant cell lines were successfully established by cisplatin induction,and its drug tolerance to DDP, vincristine and paclitaxel increased 35.83,23.74 and 10.54 times,respectively, as compared with that in CNE-1 cells,The successful rate of transplantation tumor was 83.33% by means of CNE-1/DDP resistant cells at 5×106/ml, however, transplantation tumor was not induced by the other two concentrations of drug-resistant cells,moreover, the tumor metastases in liver, lungs and other organs were not observed in all the nude mice.The expression levels of LRP, VEGF and Bcl-2 in resistant cells and transplanted tumor were significantly higher than those in CNE-1 cells (P<0.05).ConclusionThe tumorigenicity of CNE-1/cisplatin resistant cells is related with cells concentration,the transplantation tumor of CNE-1 resistant cells keeps still drug tolerance,which can provide ideal animal models for the researches about reversal agent of drug resistance of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】nasopharyngeal carcinoma；drug tolerance；transplantation tumor

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.13.001

通訊作者：朱名毅，533000廣西壯族自治區(qū)百色市，右江民族醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；

【中圖分類號】R 739.6

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)13-1925-04

(收稿日期：2016-01-11)

項目來源：廣西自然科學基金項目(編號：2013GXNSFBA019193)；右江民族醫(yī)學院大學生創(chuàng)新訓練計劃立項項目(編號：XJCXA201409)

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