郝麗紅，張秀英，張金銘，崔曉旭，孫曉琦，關(guān)舒函

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

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棕櫚酸和硬脂酸對(duì)HepG2細(xì)胞血紅素加氧酶-1和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)的影響

郝麗紅，張秀英*，張金銘，崔曉旭，孫曉琦，關(guān)舒函

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

摘要：研究棕櫚酸(PA)和硬脂酸(SA)作用HepG2細(xì)胞后，對(duì)其血紅素加氧酶-1 (HO-1)和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的影響。PA和SA分別以0.25、0.5、0.75、1.0 mmol·L-1濃度刺激HepG2細(xì)胞24 h后，采用熒光定量PCR以及蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)細(xì)胞HO-1和Nrf2的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：PA作用細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，隨著PA濃度的遞增HepG2細(xì)胞中Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)；而SA組濃度為0.25、0.5、0.75 mmol·L-1時(shí)，Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著增加(P<0.01)，當(dāng)SA濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)其增加量相對(duì)減少。在1 mmol·L-1范圍內(nèi)，較高濃度的PA和較低濃度的SA對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)作用顯著。

關(guān)鍵詞：棕櫚酸；硬脂酸；HepG2細(xì)胞；血紅素加氧酶-1；核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2

棕櫚酸(PA)和硬脂酸(SA)是飽和脂肪酸(SFA)中典型代表，具有重要的生理功能，大量研究表明，SFA可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂類代謝，減少機(jī)體炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激進(jìn)而在一定程度上拮抗酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展[1]，PA和SA可以通過(guò)降低血清中膽固醇的含量而減少血栓和動(dòng)脈硬化的形成[2-4]。HepG2細(xì)胞系人肝癌細(xì)胞株，生物學(xué)特性與正常肝細(xì)胞相類似，其高度分化而易于培養(yǎng)，對(duì)遺傳病毒學(xué)以及肝疾病發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義[5]。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是抗氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)者，其特異性受體是Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)，在細(xì)胞核中形成Keap1_Nrf2/ARE通路后誘導(dǎo)多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。血紅素加氧酶-1 (HO-1) 作為Nrf2調(diào)控的下游靶基因之一，是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激酶，而其降解血紅素的產(chǎn)物膽綠素、CO和Fe2+同樣具有抗氧化作用。因此研究PA和SA與HO-1和Nrf2的相關(guān)性具有重要生物學(xué)意義[6-9]。Nrf2具有抗應(yīng)激、抗腫瘤、調(diào)節(jié)GSH合成、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)等多種功能而有望成為藥物作用的潛在靶點(diǎn)[10]，Nrf2/ARE抗氧化系統(tǒng)在肝損傷、脂肪肝、肝纖維化及肝癌等方面具有重要作用[11]，研究證明，PA引起的細(xì)胞脂毒性可以誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)增加，進(jìn)而一定程度上控制NASH的形成[12]，SA可能作為過(guò)氧化物酶增生激活受體的天然配體，并且可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[13]。而有關(guān)不同濃度PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞HO-1及Nrf2表達(dá)的影響國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，本文將主要探究這兩種飽和脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞血紅素加氧酶-1(HO-1)和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)影響。

1材料與方法

1.1材料

HepG2細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)某實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；棕櫚酸和硬脂酸購(gòu)于Sigma公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自全式金試劑公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；鼠抗人內(nèi)參β-actin和兔抗人細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗人HO-1購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 mL培養(yǎng)瓶，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后接種于六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定、融合率達(dá)80%以上時(shí)，將皂化后的PA和SA稀釋至所需濃度后加入六孔板中。其中處理組PA和SA的作用濃度分別是0.25、0.5、0.75、1.0 mmol·L-1，作用24 h，收集細(xì)胞，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.3PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)濃度的選擇

將HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，孵育過(guò)夜至融合度達(dá)80%～90%，按4、2、1、0.75、0.5、0.25 mmol·L-1濃度梯度加入PA和SA，每個(gè)濃度梯度6個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入10 mL MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，計(jì)算脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響，計(jì)算公式：

細(xì)胞成活率=(樣品孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%

1.4總RNA提取和RT-PCR檢測(cè)Nrf2和HO-1的轉(zhuǎn)錄量

用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)β-actin、Nrf2、HO-1引物，具體序列如下，β-actin上游引物：5′-GATCCACATCAGCTGGGAAGG-3′，下游引物：5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′；Nrf2上游引物：5′-CCAGCACATCCAGACAGACAC-3′，下游引物：5′-GATATCCAGGGCAAGCGACTC-3′；HO-1上游引物：5′-TCAAAGGCAGGGAAGTAGC-3′，下游引物：5′-TCAAAGGCAGGGAAGTAGC-3′。

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，立刻使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物技術(shù)公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL進(jìn)行熒光定量PCR(儀器為ABI 7500 RT-PCR SDS system)，條件為94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，通過(guò)熒光定量染料法定量。

1.5細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取及蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白質(zhì)表達(dá)量

24 h后六孔板置于冰上，棄去原培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，采用RIPA法提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，即每孔加入100 μL RIPA蛋白裂解液，作用5 min后刮取細(xì)胞于1.5 mL EP管，于4 ℃，14 000 r·min-1離心30 min，取上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按試驗(yàn)需要定量后進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，條件為100 V，2 h；經(jīng)100 V，90 min濕轉(zhuǎn)至硝基纖維素膜(NC膜)；TTBS稀釋的5%脫脂乳室溫封閉1 h(NC膜可根據(jù)目的條帶大小剪開(kāi))；兔抗人Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)一抗37 ℃孵育1 h；羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫作用1.5 h后ECL顯影。對(duì)照組為β-actin肌動(dòng)蛋白。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

2結(jié)果

2.1PA和SA對(duì)HepG2誘導(dǎo)濃度的選擇

由表1可知，與對(duì)照組相比，低濃度PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；但當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mmol·L-1時(shí)，則極顯著抑制了HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.01)，并隨著濃度的增加，細(xì)胞成活率呈逐漸下降趨勢(shì)。所以，本試驗(yàn)選擇0.25、0.5、0.75、1.0 mmol·L-1四個(gè)作用濃度。

表1　不同濃度的PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞成活率的影響

同行數(shù)據(jù)無(wú)符號(hào)表示差異不顯著(P>0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

The same line datas with no signs mean no significant difference (P>0.05)，while with * mean significant difference (P<0.05)，with ** mean significant difference (P<0.01)

2.2PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1轉(zhuǎn)錄的影響

2.2.1不同濃度PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2 轉(zhuǎn)錄的影響由圖1可知，與對(duì)照組相比，PA濃度為0.25 mmol·L-1時(shí)，Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄量變化不顯著(P>0.05)，當(dāng)PA濃度為0.5、0.75和1 mmol·L-1時(shí)，Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄量依次提高了5.27、6.97和10.47倍，差異極顯著(P<0.01)。與對(duì)照組相比，SA各濃度處理組Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄量均變化極顯著(P<0.01)，SA濃度為0.25、0.5、0.75以及1 mmol·L-1時(shí)，Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄量分別提高了8.33、15.56、18.35 和12.50倍。

2.2.2不同濃度PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞HO-1轉(zhuǎn)錄的影響由圖2可知，與對(duì)照組相比，PA各濃度處理組HO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄量均變化極顯著(P<0.01)，分別提高了7.26、18.10、21.07和25.61倍。與對(duì)照組相比，SA濃度為0.25 mmol·L-1時(shí)，HO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄量變化不顯著(P>0.05)，SA濃度為0.5、0.75和1 mmol·L-1時(shí)，HO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄量分別提高了3.98、8.22和3.40倍，差異極顯著(P<0.01)。

數(shù)據(jù)上標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同Datas with * mean significant difference(P<0.05)，with ** mean mean significant difference(P<0.01).The same as below圖1　不同濃度PA和SA對(duì)Nrf2 mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響Fig.1　Effects of different PA and SA concentrations on transcription of Nrf2 mRNA

2.3PA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

2.3.1不同濃度的PA對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響由圖3可知，與對(duì)照組相比，PA各濃度處理組Nrf2蛋白表達(dá)量均變化極顯著(P<0.01)，分別提高了0.71、0.79、1.23和1.29倍；與對(duì)照組相比，PA濃度為0.25 mmol·L-1時(shí)，HO-1蛋白表達(dá)量提高了0.25倍，變化不顯著(P>0.05)；PA濃度為0.5、0.75和1 mmol·L-1時(shí)，HO-1蛋白表達(dá)量分別提高了0.38、0.83和6.52倍，差異極顯著(P<0.01)。

圖2　不同濃度PA和SA對(duì)HO-1 mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響Fig.2　Effects of different PA and SA concentrations on transcription of HO-1 mRNA

圖3　不同濃度的PA對(duì)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)量的影響Fig.3　Effects of defferent PA concentration on protein expression of Nrf2 and HO-1

2.3.2不同濃度的SA對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響由圖4可知，與對(duì)照組相比，SA濃度為0.25、0.5和0.75 mmol·L-1時(shí)，Nrf2蛋白表達(dá)量提高了0.59、0.70和0.82倍，差異極顯著(P<0.01)；SA濃度為1 mmol·L-1時(shí)，Nrf2蛋白表達(dá)量提高了0.53倍，雖差異極顯著(P<0.01)，但不及0.25～0.75 mmol·L-1時(shí)。與對(duì)照組相比，SA濃度為0.25 mmol·L-1時(shí)，HO-1蛋白表達(dá)量提高0.44倍，差異不顯著(P>0.05)；SA濃度為0.5和0.75 mmol·L-1時(shí)，HO-1蛋白表達(dá)量提高0.80和0.84倍，差異極顯著(P<0.01)；SA濃度為1 mmol·L-1時(shí)，HO-1蛋白表達(dá)量提高0.53倍，雖差異極顯著(P<0.01)，效果不及0.5～0.75 mmol·L-1時(shí)。

圖4　不同濃度的SA對(duì)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)量的影Fig.4　Effects of defferent SA concentration on protein expression of Nrf2 and HO-1

3討論

飽和脂肪酸具有潛在的生理功能，在食物中適量添加可以對(duì)某些疾病產(chǎn)生治療作用，如胰島素抵抗(IR)、 酒精性肝病以及某些代謝性疾病。隨后研究表明，適量的PA和SA具有一定的抗炎癥和抗氧化應(yīng)激作用。SA可以通過(guò)PI-3K和PPARγ途徑來(lái)拮抗氧化應(yīng)激造成的腦片損傷[14]；Y.Nishitani等發(fā)現(xiàn)，適量攝入SA可減輕膽汁阻塞引起的肝損傷、肝纖維化以及炎癥反應(yīng)，可以作為保肝藥[15]；P.H.Pan等研究表明，適量的攝入SA可以預(yù)防酒精引起的肝損傷[16]；所以，日常飲食中合理控制飽和脂肪酸的攝入量對(duì)機(jī)體健康具有重要作用。目前，在細(xì)胞水平上，不同濃度PA及SA通過(guò)細(xì)胞關(guān)鍵信號(hào)通路對(duì)其相關(guān)代謝酶的調(diào)節(jié)作用基本沒(méi)有報(bào)道。

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合后，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活其下游的靶基因，包括過(guò)氧化物酶(CAT)、醌氧化還原酶(NQO1)以及血紅素加氧酶(HO-1)等[7]，進(jìn)而起到保護(hù)機(jī)體的作用。HO-1主要通過(guò)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也是催化血紅素生成膽綠素、CO和Fe2+的限速酶[8-9]。故提高Nrf2及其相關(guān)代謝酶的表達(dá)量可以對(duì)機(jī)體的脂肪肝和代謝綜合征等多種疾病產(chǎn)生治療和預(yù)防作用，適量的攝入PA和SA，對(duì)于保證機(jī)體的健康至關(guān)重要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的PA和SA均提高了Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)量，但提高表達(dá)量的變化趨勢(shì)不同。S.Joshi-Barve等報(bào)道，PA代謝可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS和炎性細(xì)胞因子，而ROS可誘導(dǎo)Nrf2基因的表達(dá)[17]，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)量隨PA濃度增加而逐漸提高。而SA濃度為0.75 mmol·L-1時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)量提高的最多；SA濃度為1 mmol·L-1時(shí)，提高HO-1和Nrf2的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對(duì)減少。PA和SA在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)都能增強(qiáng)HO-1和Nrf2的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)，只是不同濃度PA和SA對(duì)兩種基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加的幅度不盡相同。PA和SA作為飽和脂肪酸，對(duì)于機(jī)體代謝發(fā)揮重要的作用。PA和SA在體內(nèi)含量不同時(shí)，對(duì)于機(jī)體代謝及產(chǎn)生的生物學(xué)特征反應(yīng)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

在0.25、0.5、0.75、1.0 mmol·L-1，HepG2細(xì)胞Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)量隨PA濃度增加而逐漸提高；硬脂酸(SA)隨濃度增加，Nrf2和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)也呈增加趨勢(shì)，只是SA濃度較低時(shí)，誘導(dǎo)作用較強(qiáng)。

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(編輯白永平)

Effects of Palmitic Acid and Stearic Acid on Genes and Protein Expressions of Heme Oxygenase 1 and Nuclear Transcription Factor Nrf2 in HepG2 Cell

HAO Li-hong，ZHANG Xiu-ying*，ZHANG Jin-ming，CUI Xiao-xu，SUN Xiao-qi，GUAN Shu-han

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Abstract:The purpose of the study was to explore the effects of Palmitic acid (PA) and Stearic acid (SA) on genes and protein expression of heme oxygenase 1 (HO-1) and Nuclear Transcription Factor Nrf2 in HepG2 Cells.The HepG2 cells were treated with PA or SA of 0.25，0.5，0.75，1.0 mmol·L-1for 24 h，the mRNA and protein expression levels of HO-1 and Nrf2 were detected by quantitative reverse transcription PCR and western blotting，separately.The experimental results were as follows，compared with the control group，the mRNA and protein expressions of HO-1 and Nrf2 were significantly increased with the increasing of PA concentration (P<0.01)；While the mRNA and protein expressions of HO-1 and Nrf2 were significantly increased with SA of the concentrations of 0.25，0.5，0.75 mmol·L-1(P<0.01)，the increased amount of the mRNA and protein expressions of HO-1 and Nrf2 were relatively decreased when the concentration of SA was 1.0 mmol·L-1.In conclusion，a relatively higher concentration of PA and a relatively lower concentration of SA can elevate the mRNA and protein expressions of HO-1 and Nrf2 significantly within 1 mmol·L-1in HepG2 cells.

Key words:palmitic acid；stearic acid；HepG2 cells；heme oxygenase 1；nuclear transcription factor Nrf2

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.025

收稿日期：2015-07-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172369)

作者簡(jiǎn)介：郝麗紅(1989-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：15546036683@163.com

*通信作者：張秀英

中圖分類號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0603-06