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        EB病毒感染的核酸檢測:標(biāo)本類型的選擇

        2016-07-13 08:06:23郭建巍
        分子診斷與治療雜志 2016年3期
        關(guān)鍵詞:血漿標(biāo)本

        郭建巍

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        ·述評(píng)·

        EB病毒感染的核酸檢測:標(biāo)本類型的選擇

        郭建巍★

        [摘要]近年來的研究表明,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染與多種疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。由于EB病毒獨(dú)特的感染方式,其實(shí)驗(yàn)室診斷特別是核酸檢測顯得尤為重要。本文就EB病毒的生物學(xué)特性、感染方式、抗體產(chǎn)生,特別是核酸檢測中標(biāo)本類型的選擇、標(biāo)準(zhǔn)化以及未來的檢測方向等問題進(jìn)行了述評(píng)和展望,以期為EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后評(píng)判提供更準(zhǔn)確的核酸檢測結(jié)果。

        [關(guān)鍵詞]EB病毒;標(biāo)本;血漿;外周血單個(gè)核細(xì)胞

        ★通訊作者:郭建巍,E-mail:jwkuo@sohu.com

        EB病毒(epstein-barr virus,EBV)即人類皰疹病毒Ⅳ型(human herpesvirus type 4),是一種常見的人類皰疹病毒。EBV初次感染后就終生定居在B細(xì)胞中。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,約90%以上的成人EB病毒血清學(xué)反應(yīng)陽性,提示在兒童或青少年時(shí)感染過EB病毒[1]。

        近年來大量研究證明,EBV與人群鼻咽癌、何杰金病、T/NK細(xì)胞淋巴瘤(T/Natural killer cell lymphoma)、Burkitt淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān),還與免疫抑制劑使用患者和多種免疫缺陷性疾病患者移植后淋巴細(xì)胞增殖性異常(post-transplant lymphoproliferative disorders,PTLD)、移植后平滑肌腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)相關(guān)性淋巴瘤、多發(fā)性硬化、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤或平滑肌肉瘤密切相關(guān)[2-7]。由于EBV廣泛的疾病譜,EBV已成為許多學(xué)者研究和關(guān)注的焦點(diǎn)。

        在EBV感染的臨床診斷中,臨床醫(yī)生必須要弄清楚幾個(gè)問題:患者是否感染EBV?EBV感染處于什么時(shí)相?是否為EBV的活動(dòng)性感染?所患疾病是否與EBV感染相關(guān)?只有弄清楚了這幾個(gè)問題,才能對EBV相關(guān)疾病的診療有一個(gè)全面而整體的認(rèn)識(shí),才好有的放矢、對癥治療。而要回答這些問題,就必須要了解EBV的生物學(xué)特性及其特殊的感染形式。本文就EBV生物學(xué)特性及感染方式、EBV感染類型及免疫相關(guān)指標(biāo)、感染后的實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)、核酸檢測標(biāo)本類型的選擇、標(biāo)準(zhǔn)化等問題進(jìn)行討論,以期為EBV感染相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后評(píng)判提供科學(xué)依據(jù)(表1)[8]。

        表1 EBV相關(guān)性疾病核酸檢測建議使用的標(biāo)本類型[8]Table 1 Suitable type of specimens preferred in nucleic acid detections in different epstein-barr virus-associated diseases[8]

        1 EBV生物學(xué)特性及感染方式

        EBV是線性雙鏈?zhǔn)菳細(xì)胞DNA病毒,基因組長172 kb,包括編碼衣殼抗原(viral capsid antigen,VCA)、早期抗原(early antigen,EA)和核抗原(nuclear antigen,NA)的基因。EBV基因組大部分是相同的,在編碼EBV核抗原(EBV nuclear antigen,EBNA)2,EBNA 3A,EBNA 3B及EBNA 3C的基因亞型中存在一些等位基因多態(tài)性的亞型,Ⅰ型在西方國家和東南亞居多,非洲地區(qū)Ⅰ型和Ⅱ型同時(shí)存在。

        人是EBV感染的惟一宿主,由于B細(xì)胞表面有EBV受體分化群抗原21(cluster of differentiation antigen,CD21)分子,EBV能直接感染侵入B細(xì)胞并使其永生化,或以郎罕氏細(xì)胞介導(dǎo)的方式感染口咽部上皮細(xì)胞,入血后再感染B淋巴細(xì)胞。由于絕大多數(shù)上皮細(xì)胞缺少CD21分子,EBV侵入上皮細(xì)胞的機(jī)制要比侵入B細(xì)胞復(fù)雜。一般認(rèn)為EBV原發(fā)性感染發(fā)生在口腔,口咽部上皮細(xì)胞和B細(xì)胞為EBV主要宿主細(xì)胞,EBV也可感染T細(xì)胞、NK細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞等。根據(jù)EBV感染時(shí)間和EBV感染后產(chǎn)生的特異性抗體譜,可將EBV的感染分為原發(fā)感染、潛伏和激活3種類型。

        EBV通過病毒包膜糖蛋白gp350與B細(xì)胞表面CD21分子結(jié)合,接著EBV gp42與B細(xì)胞上人白細(xì)胞抗原Ⅱ類分子(human leucocyte antigenⅡ,HLA-Ⅱ)結(jié)合而促進(jìn)膜融合,EBV進(jìn)入B細(xì)胞并擴(kuò)增,表達(dá)病毒特異性抗原分子,誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答,活化NK細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生EBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(EBV-specific cytotoxic T lymphocytes,CTL),抑制并最終清除EBV陽性B細(xì)胞。EBV原發(fā)感染消退快,僅于部分記憶性B細(xì)胞內(nèi)建立持續(xù)甚至終身性潛伏,因此傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis,IM)[9]一般呈良性自限性,IM發(fā)病過程是機(jī)體免疫控制EBV的結(jié)果。急性感染痊愈后的個(gè)體內(nèi)有百萬分之一的B細(xì)胞會(huì)攜帶有EBV基因組,這也是EBV感染的一個(gè)重要特性。

        2 EBV感染類型及免疫相關(guān)指標(biāo)

        EBV原發(fā)感染后,體內(nèi)首先出現(xiàn)EBV衣殼抗原特異性 IgM 抗體(viral capsid antigen IgM antibody,VCA-IgM),隨后出現(xiàn)EBV衣殼抗原特異性IgG抗體(viral capsid antigen IgM antibody,VCA-IgG),急性感染的晚期出現(xiàn)抗早期抗原(early angtigen,EA)抗體,而EBNA IgG抗體陰性。

        在潛伏期,多數(shù)細(xì)胞中的EBV基因組處于潛伏狀態(tài),此時(shí)細(xì)胞只合成EBNA、EB病毒編碼的小RNA(EBV encoded small RNA,EBER)和潛伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP),包括EBNA 1-2,EBNA 3A-3C,EBER1,EBER2,LMP1及LMP2A。處于潛伏期的EBV并不復(fù)制,絕大多數(shù)存在于記憶性B細(xì)胞上,被感染的記憶性B細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)時(shí)血中可檢測到病毒。目前認(rèn)為有5種EBV感染類型,即溶解型、0型、Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同的感染類型與不同的臨床疾病密切相關(guān)。在溶解型中,被感染的細(xì)胞為淋巴組織中的漿細(xì)胞,漿細(xì)胞被感染后,EBV在漿細(xì)胞中復(fù)制,表達(dá)溶解基因,導(dǎo)致EBV復(fù)活,最后導(dǎo)致細(xì)胞的溶解;0型指EBV感染處于潛伏狀態(tài),被感染的細(xì)胞為外周血記憶細(xì)胞,處于0型感染的EBV在患者體內(nèi)終生存在,此型感染屬于EBV健康攜帶者;在Ⅰ型潛伏感染中,被感染的細(xì)胞為外周血記憶細(xì)胞,主要見于Burkitt淋巴瘤細(xì)胞,EBNA只表達(dá)EBNA1基因;在Ⅱ型潛伏感染中,被感染的細(xì)胞為淋巴組織中的生發(fā)中心細(xì)胞,Ⅱ型潛伏感染與鼻咽癌、NK細(xì)胞淋巴瘤和何杰金病有關(guān),此時(shí)病毒處于沉默期,被感染細(xì)胞中出現(xiàn)EBNA1及LMP1/2A等病毒產(chǎn)物;在Ⅲ型潛伏感染中,被感染細(xì)胞為淋巴組織中的幼稚細(xì)胞,表達(dá)EBNA1,EBNA2,EBNA3A-C,EBNA-LP,LMP1,LMP2A+B等基因,活化B細(xì)胞,在急性傳染性單核細(xì)胞增多或移植后淋巴細(xì)胞增生性異?;颊咧锌捎^察到Ⅲ型潛伏感染。

        EBV原發(fā)感染4~6個(gè)月后體內(nèi)檢測到的抗體主要為IgG型抗體,代表性抗體為VCA-IgG和EBNA-IgG[10],EBV既往感染表明曾經(jīng)發(fā)生EBV感染,但目前無活動(dòng)性EBV感染的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。免疫功能正常,EBNA-IgG抗體陽性者如EA抗體滴度顯著高,一般表明存在EBV感染激活或再燃。EBV原發(fā)感染后,部分感染者特異性EA抗體可能持續(xù)數(shù)年而并無臨床癥狀,因此,是否存在活動(dòng)性EBV感染相關(guān)臨床表現(xiàn)也是診斷EBV感染激活的重要依據(jù)。此時(shí)如果動(dòng)態(tài)檢測血液中的EBV核酸將對疾病的診斷及轉(zhuǎn)歸判斷提供重要依據(jù)。

        3 EBV感染后的實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)

        可以說機(jī)體的免疫功能狀況是決定EBV潛伏感染狀態(tài)和EBV相關(guān)疾病發(fā)生乃至發(fā)展的重要因素。被感染的B細(xì)胞偶爾會(huì)受到刺激而重新激活,激活的病毒可再感染新的B細(xì)胞和上皮細(xì)胞,使處于潛伏狀態(tài)下的EBV再次激活并大量復(fù)制,導(dǎo)致IM癥狀持續(xù)存在或退而復(fù)現(xiàn)稱為慢性活動(dòng)性EBV感染(chronic active EBV infection,CAEBV)。EBV感染T/NK細(xì)胞并造成其克隆性增生且不能產(chǎn)生足夠的CTL可能是其發(fā)病的主要原因。目前對病毒再激活的分子機(jī)制目前仍無清晰的認(rèn)識(shí)。深入了解每種基因產(chǎn)物在EBV相關(guān)疾病發(fā)病中作用會(huì)幫助臨床醫(yī)生制定出更多合理、有效的預(yù)防及治療策略。

        目前常用的用于EBV感染的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有嗜異性抗體檢測、血液細(xì)胞分析即血常規(guī)、異型淋巴細(xì)胞分型、EBV特異性抗體檢測及分型、EB病毒核酸定量和EBER原位雜交。EBER已成為組織和細(xì)胞中EBV檢測的金標(biāo)準(zhǔn),并廣泛應(yīng)用于臨床病理學(xué)診斷。熒光定量PCR(fluorescent quantita-tive polymerase chain reaction,F(xiàn)Q-PCR)可用于定量檢測體液及組織樣本中的EBV拷貝數(shù),特別適用于移植病人EBV相關(guān)疾病的感染監(jiān)測;通過檢測腦脊髓液中的EBV核酸可診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否有EBV感染;對非典型臨床癥狀患者或嗜異凝集試驗(yàn)陰性的IM幼兒通過EBV核酸定量可做出實(shí)驗(yàn)室診斷;通過EBV核酸定量可評(píng)價(jià)抗EBV治療的療效;檢測血漿中EBV核酸水平對鼻咽癌的的診斷、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后判斷均有重要意義[10]。

        4 EBV核酸檢測標(biāo)本類型的選擇

        關(guān)于血液中EBV檢測標(biāo)本類型的選擇有許多爭議,其焦點(diǎn)來源于EBV在血漿中拷貝數(shù)比在全血樣本中的拷貝數(shù)低10~100倍,因此多數(shù)人還是傾向于全血。近年來,熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用于EBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷[11],也是EBV核酸定量的金標(biāo)準(zhǔn),目前至少有10種不同的熒光定量PCR商用試劑在中國、美國和歐洲等國家和地區(qū)使用[12],除在鼻咽癌的診斷中EBV DNA有一定的缺陷外,在其他感染性疾病的診斷中均發(fā)揮了重要的作用。

        一般來說,外周血中的EBV DNA可以溶解的線型或游離循環(huán)DNA形式出現(xiàn),線型的DNA在EBV重新活化、伴隨著宿主細(xì)胞溶解和產(chǎn)生病毒體時(shí)均可在血液中檢測到,游離的DNA在潛伏感染的B細(xì)胞中也可檢測到。此外,凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放的裸露的無細(xì)胞EBV DNA也可在外周血中檢測到。在EBV重新激活時(shí)釋放病毒,此時(shí)要檢測血清或血漿,因?yàn)槠浒c細(xì)胞無關(guān)的DNA,如果要檢測全血中與細(xì)胞相關(guān)DNA的話要選擇外周血單個(gè)核細(xì)胞或B細(xì)胞作為首選標(biāo)本。

        關(guān)于在熒光定量PCR檢測中如何選擇合適的標(biāo)本,表1根據(jù)不同疾病列出了EBV核酸定量中可供臨床選擇的適宜標(biāo)本類型[8]。表中對各類疾病中最合適的標(biāo)本類型進(jìn)行了推薦,但由于EBV的特殊性,在EBV相關(guān)疾病的檢測中標(biāo)本選擇目前仍不能做到唯一和絕對。通常情況下,外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的EBV載量檢測更加精確,因?yàn)樗荁細(xì)胞的在血液中停留的重要地方。對移植患者,檢測全血中EBV的核酸定量與PBMC中核酸定量同樣有效,這樣就可以避免了核酸定量檢測中由于提取PBMC產(chǎn)生的花費(fèi)與更長等待時(shí)間。也許這個(gè)模式也可用于其它EBV相關(guān)疾病的核酸檢測中,如鼻咽癌、T/NK細(xì)胞淋巴瘤、何杰金病、B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤(B cell non-hodgkin lymphomas,B-NHL),因?yàn)檫@些疾病中病毒并不能從凋亡的腫瘤細(xì)胞中釋放出來,而這些疾病目前還推薦用血漿進(jìn)行EBV核酸的定量檢測。對移植相關(guān)疾病,EBV的核酸定量顯得非常必要,為提高檢測的敏感性和特異性,對PTLD病人還要結(jié)合EBV特異性細(xì)胞免疫來進(jìn)行綜合判斷[13-15],這對區(qū)別PTLD復(fù)發(fā)和區(qū)分EBV感染后的慢性高病毒載量(chronic high viral loads,CHVL)具有重要意義。目前的臨床實(shí)踐中我們更傾向于使用PBMC和血漿中的EBV核酸定量結(jié)果來指導(dǎo)臨床診療[16],從這2種類型標(biāo)本的檢測結(jié)果還可以推算出全血中的EBV濃度,因此具有更高的實(shí)用價(jià)值。

        5 EBV核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)化

        在熒光定量PCR檢測EBV核酸定量中,還有一個(gè)亟待解決的重要問題就是定量的標(biāo)準(zhǔn)化。目前評(píng)估病毒載量的單位有全血和血漿中copies/ mL、DNA中copies/μg和copies/每個(gè)細(xì)胞,國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室用全血和血漿中IU/mL、copies/mL來表示。如果統(tǒng)一使用國際單位及標(biāo)準(zhǔn),就可使實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的比較更加有效,疾病的診斷、預(yù)后判斷及預(yù)先治療就有了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。雖然有許多學(xué)者在這方面做了大量工作,并成立了專門的國際組織,但由于不同的廠家使用的EBV靶序列區(qū)域不同、引物和探針不同,導(dǎo)致擴(kuò)增的效率也不同;此外,不同EBV基因組中重復(fù)序列不同,不同EBV相關(guān)疾病中EBV表達(dá)方式也不同,因此EBV核酸定量的標(biāo)準(zhǔn)化仍有一定的難度[17]。為了保證精確的定量,有學(xué)者推薦在核酸定量中設(shè)計(jì)引物和探針時(shí),要使用EBV中的單個(gè)高度保守區(qū)域,不建議使用BamHI-W區(qū)域,如EBNA1和BALF-5基因的BamHI-K區(qū)域[18]。從2015年開始衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心增加了巨細(xì)胞病毒核酸檢測的室間質(zhì)評(píng)工作,明確以IU/mL作為結(jié)果的表示方法。提示衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心對國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室EBV核酸檢測的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)管指日可待。

        6 EBV核酸檢測的展望

        未來EBV的核酸定量中將會(huì)增加數(shù)字PCR技術(shù)[19]。數(shù)字PCR通過計(jì)數(shù)單個(gè)分子從而實(shí)現(xiàn)絕對定量,它采用直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子數(shù)而不依靠任何校準(zhǔn)物及內(nèi)標(biāo)與外標(biāo),更容易實(shí)現(xiàn)檢測中的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)字PCR在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)前,將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到獨(dú)立反應(yīng)室,在微流控芯片上單分子間通過稀釋分離,獨(dú)自進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后分析每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。數(shù)字PCR操作方便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測通量高,已成為分子生物學(xué)研究中的重要手段。與傳統(tǒng)熒光定量PCR相比,除檢測范圍較窄的缺點(diǎn)外,數(shù)字PCR更加精確,可以檢測更低拷貝數(shù)的目標(biāo)DNA分子,同時(shí)還可以研究基因序列的變化,可為下一代測序定向克隆擴(kuò)增出樣本中的DNA分子,并實(shí)現(xiàn)病毒分子的絕對定量。在EBV的核酸檢測中如果將數(shù)字PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)配合使用,可以揚(yáng)長避短,必將為EBV相關(guān)疾病的臨床診斷提供更加準(zhǔn)確和可靠的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果。

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        What kind of specimen is used for epstein-barr virus nucleic acid detection

        GUO Jianwei★
        (Clinical Laboratory,Navy General Hospital,Beijing,China,100048)

        [ABSTRACT]In recent years,many researchers have demonstrated that epstein-barr virus(EBV)infections are associated with a broad spectrum of diseases.Due to the unique mode of infection by EBV,nucleic acid detection appears to be particularly important.In this review article,the biological characteristics,infection modes,and production of antibodies of epstein-barr virus will be discussed,as well as the suitable type of specimens,standardization and future development direction of nucleic acid detection methods in an effort to supply more accurate results for diagnosis and prognostic evaluation of EBV-associated diseases.

        [KEY WORDS]Epstein-barr virus;Specimen;Plasma;Peripheral blood mononuclear cells

        作者單位:海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100048

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