石 磊，劉 佳，郜 武，張倩暄，王 巍

1. 北京雪迪龍科技股份有限公司, 北京 102206 2. 北京航天控制儀器研究所，北京 100854

一種在線監(jiān)測的ATR探頭的設(shè)計

石 磊1，劉 佳2，郜 武1，張倩暄1，王 巍1

1. 北京雪迪龍科技股份有限公司, 北京 102206 2. 北京航天控制儀器研究所，北京 100854

生物過程是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，在反應(yīng)過程中，會產(chǎn)生固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)的過程反應(yīng)物，且具有生物活性，想要準確的掌握過程反應(yīng)物的種類與含量，必須對生物過程進行實時在線的監(jiān)測，才能夠獲得準確的數(shù)據(jù)。生物過程的原位在線分析依賴于高性能的衰減全反射探頭，衰減全反射技術(shù)是在線分析系統(tǒng)中實現(xiàn)原位在線測量的有力手段。通過分析衰減全反射技術(shù)的基本原理與特點，設(shè)計了一種成本低、光通量高、具有標準生物過程傳感器接口的中紅外衰減全反射探頭，能夠直接插入到生物反應(yīng)器中，對生物過程反應(yīng)物進行無損、零延遲的監(jiān)測。實驗結(jié)果表明，在線式ATR探頭具有較寬的光譜范圍，所采集光譜具有較高的信噪比，能夠應(yīng)用在生物過程的在線定量分析之中。

生物過程； 在線監(jiān)測； FTIR； ATR

引 言

生物發(fā)酵工程是一個非常復(fù)雜系統(tǒng)，為了提高生物產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量，同時更好的理解生物反應(yīng)過程，人們不再僅僅利用靜態(tài)的數(shù)據(jù)(如原始材料、最終產(chǎn)物與操作條件等三類數(shù)據(jù))來對生物發(fā)酵工程進行分析與優(yōu)化[1-2]； 而是深入到生物過程的工藝過程之中，實時、在線的測量生物過程反應(yīng)物的相關(guān)信息來控制或優(yōu)化生物發(fā)酵過程，最終提高生產(chǎn)效率與產(chǎn)品質(zhì)量[3-4]。

目前用于生物過程的在線分析技術(shù)(in-line)按照分析原理的不同，主要有： 色譜、質(zhì)譜、光譜及各種技術(shù)的聯(lián)合使用等。紅外光譜技術(shù)與其他種類的分析技術(shù)相比，具有以下特點[1, 5]： ①能夠用于各種復(fù)雜形態(tài)的混合物的檢測，無需樣品預(yù)處理就可以一次獲得多種物質(zhì)的光譜，檢測速度快，準確性高[6-8]； ②對物質(zhì)進行定量或定性分析，重復(fù)性高，儀器工作穩(wěn)定； ③能夠?qū)崿F(xiàn)原位在線分析，實時獲取物質(zhì)的成分。

生物過程紅外在線分析系統(tǒng)中，中紅外光的傳遞與高性能衰減全反射(attenuated total reflection, ATR)探頭的研制，一直是難于解決的問題。本工作在分析衰減全反射原理、不同種類中紅外光纖與傳導(dǎo)特性的基礎(chǔ)之上，設(shè)計了一種低成本、高光通量的紅外探頭，配合液氮制冷型MCT探測器，能夠獲取噪聲小、可靠性高的光譜信息，能夠?qū)嶋H應(yīng)用在生物過程的在線分析之中。

1 基本原理

生物過程紅外在線分析系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)如圖1中虛線框所示，主要由一臺中紅外光譜儀與插入到生物反應(yīng)器中的探頭組成，中紅外光纖將光譜儀與ATR探頭連接在一起，保證紅外光能夠高效的進行傳導(dǎo)[1, 2, 9]。

圖1 紅外在線分析儀的基本結(jié)構(gòu)

ATR探頭是根據(jù)衰減全反射的基本原理來設(shè)計的，根據(jù)電磁場的基本理論，全發(fā)射所產(chǎn)生的反射光波是先透射到第二介質(zhì)一定深度，再重新返回第一介質(zhì)之后，沿反射光波方向出射(如圖2所示)。假設(shè)入射平面光波為

(1)

式中，A為電場的振幅矢量，表示平面波的偏振方向；k=2π/λ，表示波傳播方向上波矢量的大?。?(cosα, cosβ, cosγ)代表波矢量的方向向量；ω=2πv/λ，為時間角頻率，v為介質(zhì)中平面波的傳播速度。則透射光波可以表示為

(2)

表明透射光波是一個沿x方向傳播，振幅沿z軸方向指數(shù)衰減的波，振幅隨著透射到介質(zhì)中的深度的增加而急速下降，故稱此波為“倏逝波”[9-10]。

圖2 倏逝波的穿透深度

通常將光波在z軸方向的振幅衰減到入射前的1/e時，所穿透的距離，稱為穿透深度[9]

(3)

其中，λ1=λ/n1。由以上的討論可知，穿透深度的大小一般為波長量級，因此樣品要與晶體充分、緊密接觸，而光波的穿透深度越大，能夠攜帶的樣品信息就越強。光波的入射角是影響穿透深度的重要參數(shù)，入射角與穿透深度的關(guān)系如圖3所示，當(dāng)入射角趨近于臨界入射角時，穿透深度將趨于無窮大[10]。

圖3 入射角與穿透深度的關(guān)系

2 在線式ATR探頭的設(shè)計

在線式ATR探頭的設(shè)計需要考慮： 傳導(dǎo)光纖的傳導(dǎo)效率、光通量，晶體材料的光譜范圍，晶體硬度與酸堿忍耐度和晶體的折射率、探頭的耐壓與耐熱性能等因素。晶體的外形設(shè)計也會影響到以上的幾個參數(shù)，從而影響到ATR探頭的性能。此外，晶體的大小與晶體對固體、液體與其他形態(tài)樣品的適應(yīng)性等因素也應(yīng)予以重視[6, 11]。

2.1 中紅外光纖

光纖在中紅外波段的衰減一般比較大，且價格較高，一般的硫化物紅外(chalcogenide infra-red, CIR)玻璃光纖透光波段為1.5～6 μm，難以應(yīng)用在中紅外波段的物質(zhì)分析，而復(fù)合多晶紅外(polycrystalline infra-red, PIR)光纖的透光波段能夠達到4～18 μm，能夠滿足大多數(shù)中紅外的分析應(yīng)用。如圖4所示，典型的硫化物紅外光纖與復(fù)合多晶紅外光纖在1.5 m的長度下所測得的透射率。

圖4 典型的硫化物紅外光纖與復(fù)合多晶紅外光纖的透射率

與實芯的紅外光纖不同，空芯的紅外光波導(dǎo)的內(nèi)部是空芯的，對光波的傳導(dǎo)主要是通過空氣進行的。如圖5所示為Harrington[12]的科研團隊所研制的如今使用最為廣泛的一種空芯光波導(dǎo)(hollow glass waveguide, HWG)。其內(nèi)部以石英管作為基底，在石英管的內(nèi)部涂有一層很薄的銀膜，在銀膜的內(nèi)部是碘化銀形成的介電層，介電層內(nèi)表面高度光滑，并且具有極強的反光能力； 石英管的外部是一層聚合物涂層起保護作用，但不會影響空心光波導(dǎo)的光學(xué)屬性。

圖5 空芯光波導(dǎo)的結(jié)構(gòu)圖

與紅外晶體光纖相比，空芯光波導(dǎo)具有更高的傳輸效率，更高的功率閾值，更寬的光譜范圍，更低的非線性，且沒有末端反射； 同時，對可見光的敏感度要比晶體光纖低，故具有更長的使用壽命[12]。空芯紅外光波導(dǎo)具有很低的光束發(fā)散度和能量衰減，這兩項因素正比于a-3，a為其孔半徑； 但其缺點是彎曲損失率高，正比于R-1，R為彎曲半徑。

2.2 ATR晶體材料

為了能夠適用于溶液、固體、流體、有機物等各種不同種類物質(zhì)的檢測，ATR晶體材料的折射率，一般取當(dāng)入射光波為2 000 cm-1時，在2.38～4.01之間[9-10]。

如表1所示，給出了常用ATR晶體材料的主要參數(shù)，其中穿透深度的值是在波數(shù)為1 000 cm-1，折射率n1=1.5，入射角度為45°的條件下，計算所得； 晶體的水溶性的單位為g·100 mL-1； 光譜范圍的單位為cm-1； 硬度的單位為kg·mm-1。

表1 常用ATR晶體材料的特性

2.3 在線式ATR探頭的基本光路

考慮到光譜儀輸出的紅外光束具有一定孔徑，而中紅外HWG的孔徑一般在1 mm左右，且其入射的數(shù)值孔徑一般在0.01～0.05之間[12]，因此，紅外光斑不僅要匯聚的很小，而且還要控制較小的入射角度范圍內(nèi)。如圖6所示為，所設(shè)計的HWG耦合光路，首先利用離軸拋物面鏡將口徑較大平行紅外光束進行匯聚，再通過聚光鏡A將紅外光束變?yōu)榭趶捷^小的平行光束，最后再經(jīng)過聚光鏡B將紅外光束耦合到HWG之中。

圖6 空芯光波導(dǎo)耦合光路

選用硒化鋅材料作為ATR探頭的晶體材料，ATR探頭的幾何外形、全內(nèi)反射次數(shù)、反射角度等參數(shù)是決定其性能的主要參數(shù)，其設(shè)計還需要考慮生物過程反應(yīng)器預(yù)留的標準插槽的尺寸限制[13]。如圖7所示，為全內(nèi)反射角為45°時的ATR探頭的結(jié)構(gòu)示意圖，紅外光在ATR晶體內(nèi)發(fā)生2次全內(nèi)反射，在1 000 cm-1波段，樣品折射率n=1.5的條件下，可以計算其有效穿透深度約為8.72 μm。

利用內(nèi)徑為2 mm，外徑為3.5 mm的大孔徑光波導(dǎo)，以及硒化鋅晶體來實現(xiàn)的ATR探頭，其基本結(jié)構(gòu)如圖8所示，C1—C7為七面硒化鋅材料的透鏡，平行干涉紅外光經(jīng)過聚光鏡C1后匯聚到焦距較小的聚光鏡C2的焦點，再由的C2將紅外光準直為光斑較小的平行光，再經(jīng)C3匯聚為光波導(dǎo)孔徑范圍內(nèi)(光斑直徑與發(fā)散角)，再經(jīng)光波導(dǎo)傳播后紅外光入射到C4，C4將發(fā)散的紅外光進行匯聚入射到硒化鋅晶體內(nèi)發(fā)生兩次45°的全內(nèi)反射，出射的紅外光再經(jīng)C5—C7的匯聚到達液氮制冷的MCT探測器，從而完成對物質(zhì)的分析。這種方式能夠?qū)崿F(xiàn)光通量較大的紅外ATR探頭，對物質(zhì)含量的分析也更加靈敏。

圖7 全內(nèi)反射角為45°時的ATR探頭

圖8 ATR探頭的基本結(jié)構(gòu)

3 實驗分析

3.1 離線實驗分析

如圖9(a)所示為在4 cm-1的條件下，采用在線式ATR探頭，配合液氮制冷的MCT探測器，連續(xù)16次采集測得的空氣的紅外光譜圖，其有效的光譜范圍為3 300～750 cm-1。圖9(b)為所測得的100%基線，可以得到光譜的信噪比約為3 150∶1。

配制一系列已知濃度的甲醇樣品，使用紅外在線分析儀進行測試，以純水作為背景，在室溫條件，以4 cm-1的分辨率，連續(xù)16次采集得到一張某濃度的樣品光譜。如圖10所示，為7種已知濃度甲醇樣品的光譜圖，通過校正基線算法，ATR校正算法對吸收譜進行處理，并計算吸收峰面積的方式來對甲醇的濃度進行標定。

利用最小二乘法，得到甲醇濃度與其吸收峰面積之間的線性關(guān)系可以表示為

y=-0.132 11+3.644 69x

(4)

其中，截距與斜率的標準差分別為0.119 18與0.223 43。

圖9 在線ATR探頭測得的光譜

3.2 在線實驗分析

在實際的菌種培養(yǎng)過程中，對發(fā)酵過程進行實時監(jiān)測，以得到菌種對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況，并根據(jù)其消耗趨勢對營養(yǎng)物質(zhì)進行補充。在容積為50 L生物反應(yīng)器中，加入20 L的培養(yǎng)基底，再加入一定濃度的酵母菌“種子”，并在30 ℃恒溫條件下進行培養(yǎng)。生物反應(yīng)器配備有轉(zhuǎn)速可控的攪拌器，溶氧電極與尾氣數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，其溫度與pH值都可進行自動控制。紅外在線分析儀以未加入營養(yǎng)物的培養(yǎng)液基底作為背景，在分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次的條件下，進行在線的紅外光譜采集。

為了驗證儀器性能，當(dāng)在菌種生長到一定階段之后，開始使用甲醇作為營養(yǎng)成分，初始加入了約15 g·L-1的甲醇，當(dāng)甲醇被消耗到一定程度時，開始以一定的速度自動補充甲醇。如圖11所示為甲醇濃度的變化情況以及采用離線采樣紅外光譜法對其進行驗證。

4 結(jié) 論

在線式ATR探頭，能夠直接插入到生物反應(yīng)器之中，光譜采集無需進行任何采樣品與預(yù)處理，也不會對生物過程造成任何影響，能夠快速直接的對生物過程進行實時監(jiān)控。本工作所設(shè)計的在線式ATR探頭，成本低、光通量大等優(yōu)點，能夠?qū)ι镞^程中所涉及的原料、中間產(chǎn)物與最終產(chǎn)品等進行定性或定量分析，能夠很好的滿足生物過程的需求。隨著工業(yè)生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在線式ATR探頭的應(yīng)用需求會越來越大。

圖10 一系列不同濃度甲醇的校準曲線

圖11 某次培養(yǎng)過程中甲醇濃度的變化曲線

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(Received Nov. 11, 2014; accepted Feb. 18, 2015)

The Design of an ATR Probe for Online Monitoring of Biological Process

SHI Lei1，LIU Jia2，GAO Wu1，ZHANG Qian-xuan1，WANG Wei1

1. Beijing SDL Technology Co., Ltd., Beijing 102206，China 2. Beijing Institute of Aerospace Control Devices, Beijing 100854，China

The in situ biological process relays on a high performance attenuated total reflection (ATR) probe while ATR technique is a powerful tool for inline analysis. The basic principle and characteristic of the ATR technique was analyzed in this paper. A low cost and high throughout ATR probe was designed which can be inserted into the biological reactor directly with nondestructive and zero delay monitoring. It shows that the online ATR probe has a wide spectrum range, and the collected spectra has a high signal-to-noise ratio, which can be used in in-line quantitative analysis for biological process.

Biological process; Inline monitoring; FTIR; ATR

2014-11-11，

2015-02-18

國家重大儀器專項課題(2013YQ060615)資助

石 磊，1986年生，北京雪迪龍科技股份有限公司博士 e-mail： 998sl@sina.com

TH765.2

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1954-05