唐家明，呂 林，張麗陽(yáng)，鄒亞學(xué)，王秋悅，羅緒剛*，李素芬**

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600， 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)

不同接種密度對(duì)Caco-2細(xì)胞吸收模型分化及去極化評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

唐家明1，呂 林2，張麗陽(yáng)2，鄒亞學(xué)1，王秋悅1，羅緒剛2*，李素芬1**

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600， 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所)

為確定不同接種密度對(duì)Caco-2細(xì)胞吸收模型分化及去極化評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，以及細(xì)胞模型適用于吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)的時(shí)間，采用Caco-2細(xì)胞高密度(1×105cells·cm-2)、中密度(5×104cells·cm-2)和低密度(3×104cells·cm-2)等3個(gè)接種密度，分別接種于帶聚碳酸酯微孔濾膜插槽的Transwell 6孔板上，培養(yǎng)29 d，通過(guò)測(cè)定跨膜電阻值(TEER)、堿性磷酸酶活性(ALP)和酚紅透過(guò)率，評(píng)價(jià)細(xì)胞單層的完整性、極化和透過(guò)性。結(jié)果表明，高、中、低密度接種分別于第12天、第15天和第18天TEER值超過(guò)600 Ω·cm2，第27天、第29天和第29天TEER值開(kāi)始下降。高、中、低密度接種分別于第15天、第18天和第21天上下側(cè)堿性磷酸酶活性的比值都能達(dá)到10倍以上，第29天開(kāi)始降低。高、中、低密度接種分別于第9天、第12天和第15天酚紅透過(guò)率小于0.5%。綜合以上3項(xiàng)指標(biāo)，高密度接種細(xì)胞在第15天、中密度接種細(xì)胞在第18天、低密度接種細(xì)胞在第21天開(kāi)始，可以用于吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，27 d以后細(xì)胞活力就開(kāi)始下降，不適合做細(xì)胞模型。

Caco-2細(xì)胞；跨膜電阻(TEER)；堿性磷酸酶(ALP)；酚紅

Caco-2細(xì)胞在體外聚碳酸酯微孔濾膜上培養(yǎng)時(shí)，能自發(fā)分化并形成類似腸道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征和生化特性，如在細(xì)胞間形成緊密連接，在細(xì)胞表面形成良好的刷狀緣和微絨毛結(jié)構(gòu)，并可分泌水解酶以及合成轉(zhuǎn)運(yùn)糖、氨基酸和藥物等的載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等[1]。因此，該模型在藥理[2]、毒理[3]、生化[4]以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[1，5]等研究方面具有良好的穩(wěn)定性和重演性[6]。細(xì)胞跨膜電阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)是評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞單層完整性的主要指標(biāo)[7～9]，堿性磷酸酶活性(Alkaline phosphatase，ALP)則是細(xì)胞分化而具有極性的標(biāo)識(shí)性指標(biāo)[10,11]，而細(xì)胞單層的透過(guò)性是細(xì)胞能否用于吸收模型的關(guān)鍵[12,13]。然而，細(xì)胞的分化速度及去極化時(shí)間受細(xì)胞接種密度的影響[14]。至今尚未見(jiàn)到不同接種密度Caco-2細(xì)胞分化及去極化時(shí)間的系統(tǒng)報(bào)道。因此，筆者擬通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和TEER值、ALP活性和酚紅透過(guò)率等3個(gè)細(xì)胞模型構(gòu)建關(guān)鍵指標(biāo)的測(cè)定，評(píng)價(jià)細(xì)胞模型構(gòu)建中不同時(shí)間細(xì)胞分化及去極化狀態(tài)，為Caco-2細(xì)胞用于體外模擬小腸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)模型的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；DMEM(Dulbecco’s minimum essential medium)培養(yǎng)基(中科邁晨科技有限公司)；非必需氨基酸、雙抗(青、鏈霉素)、胰蛋白酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002 g/L的EDTA溶液)、L-谷氨酰胺和Hanks緩沖液(HBSS，pH7.4)引自Gibco公司；胎牛血清(Cat No: SH30084.03E)引自Hyclone公司；堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))。

1.2 儀器和耗材

Millicell-ERS電阻儀購(gòu)自美國(guó)MilliPore公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Model 3110 series, Thermo electron corporation，Marietta, Ohio)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；CK41型倒置生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；酸度計(jì)購(gòu)自美國(guó)HANNA公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)湘儀公司；超凈工作臺(tái)(YJ-1450型)購(gòu)自蘇州長(zhǎng)橋凈化設(shè)備廠；25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Cat No: 430167)和帶聚碳酸酯微孔濾膜插槽的Transwell6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Cat No：3450)均購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning)中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為DMEM高糖混合培養(yǎng)基，其主要成分(含量)如下：胎牛血清(體積分?jǐn)?shù)0.10)、非必需氨基酸(質(zhì)量濃度10 g/L)、L-谷氨酰胺(2 mmol·L-1)、青霉素(100 000 U·L-1)、鏈霉素(100 mg·L-1)和DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液。細(xì)胞在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2和90%相對(duì)濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，Marietta，Ohio)中進(jìn)行培養(yǎng)。接種后48 h進(jìn)行換液，之后每天換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%鋪滿瓶底時(shí)(4～5 d)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)廢液，用HBSS沖洗2～3遍，然后加入0.5 mL含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，細(xì)胞脫壁后，用吸管吹打成懸浮液，按1∶3比例接種于新的25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 Caco-2細(xì)胞模型的構(gòu)建

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%鋪滿瓶底時(shí)(4～5 d)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)廢液，用HBSS沖洗2～3遍，然后加入0.5 mL含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，細(xì)胞脫壁后，用吸管吹打成懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別按高密度(1×105cells·cm-2)、中密度(5×104cells·cm-2)和低密度(3×104cells·cm-2)接種1.5 mL細(xì)胞懸液于6孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的插入槽中(膜孔徑0.4 μm，生長(zhǎng)面積4.7 cm2)，作為轉(zhuǎn)運(yùn)槽頂膜側(cè)(Apical side，AP)，插槽下層加入2.6 mL混合培養(yǎng)基，作為基底側(cè)(Basolateral side，BL)。第1周每48 h進(jìn)行換液，一周之后每24 h換液。

1.5 Caco-2細(xì)胞模型的評(píng)估

分別于細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間在顯微鏡(Olympus CK41，日本)下觀察細(xì)胞形態(tài)變化與生長(zhǎng)狀況。在細(xì)胞模型建立過(guò)程中，用Millcell-ERS電阻儀于第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天，第23天，第25天，第27天和第29天測(cè)量細(xì)胞TEER值。將電極兩端依次插入6孔Transwell培養(yǎng)槽各孔的上下孔中檢測(cè)電阻值，同時(shí)測(cè)定空白(未接種細(xì)胞)電阻值，最后的TEER值為扣除空白值后的電阻值與生長(zhǎng)面積的乘積，以Ω·cm2為單位表示。

在細(xì)胞接種第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天，第23天，第25天，第27天和第29天，分別收集上、下兩側(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基，按堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上、下兩側(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶活力(金氏單位/100 mL)，計(jì)算上、下兩側(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶活力的比值。

在細(xì)胞接種的第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天，第23天，棄去Transwell 6孔板中上、下兩側(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的無(wú)酚紅培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中平衡30 min，然后棄去無(wú)酚紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)板上層加入含酚紅濃度為20 mg·L-1的預(yù)熱培養(yǎng)基1.5 mL，下層加入無(wú)酚紅培養(yǎng)基2.6 mL，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育3 h。取出培養(yǎng)板，收集上、下側(cè)培養(yǎng)液。取0.25 mL上、下側(cè)培養(yǎng)液加入0.5 mL 1 mol·L-1硼酸-氫氧化鈉緩沖溶液，搖勻后，以1 mol·L-1硼酸-氫氧化鈉緩沖溶液為空白，560 nm測(cè)定吸收度(OD)。

酚紅透過(guò)率=[OD下層/(OD上層+OD下層)]×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SAS(9.0)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差分析差異顯著者，采用Duncan’s法比較平均數(shù)間的差異顯著性。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05認(rèn)為是差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

體外培養(yǎng)的Caco-2上皮細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，其在培養(yǎng)瓶中呈膜狀貼壁型生長(zhǎng)。單個(gè)細(xì)胞形態(tài)為扁平狀，呈多角形，胞體近中央可見(jiàn)圓形細(xì)胞核。當(dāng)將細(xì)胞接種在聚碳酯微孔濾膜上時(shí)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)自發(fā)進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的分化，在細(xì)胞表面形成良好的刷狀緣以及在細(xì)胞間形成緊密連接，從而形成緊密的細(xì)胞單層。細(xì)胞之間緊密連接，高密度接種在第4天就能鋪成單層膜結(jié)構(gòu)，而低密度接種

圖1 Caco-2生長(zhǎng)至第21天的顯微鏡照片(200×)

在第6天鋪成單層膜結(jié)構(gòu)，到第15天以后單層膜明顯整體呈“鋪路石樣形態(tài)”。圖1為接種在聚碳酯微孔濾膜上的細(xì)胞生長(zhǎng)至第21天的細(xì)胞單層。

2.2 跨膜電阻值

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，接種不同密度的細(xì)胞單層兩側(cè)之間的跨膜電阻也迅速增加(表1)。高密度接種第12天，TEER值超過(guò)600 Ω·cm2；第18天～第25天，TEER值增長(zhǎng)緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定；第27天TEER值開(kāi)始下降。中密度接種第15天，TEER值超過(guò)600 Ω·cm2；第18天～第27天，TEER值增長(zhǎng)緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定；第29天TEER值開(kāi)始下降。低密度接種第18天，TEER值超過(guò)600 Ω·cm2；第21～27天TEER值增長(zhǎng)緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定；第29天TEER值開(kāi)始下降。除中密度接種第27天TEER值高于其他兩個(gè)接種密度外，第3天～第25天TEER值由高到低呈現(xiàn)高密度接種、中密度接種、低密度接種的變化趨勢(shì)(P<0.01)，但第29天3種接種密度的TEER值均降低至相近數(shù)值。

2.3 堿性磷酸酶活性

隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，上下側(cè)堿性磷酸酶活性比值也迅速增加(表2)。高密度接種第15天、中密度接種第18天和低密度接種第21天，上下側(cè)堿性磷酸酶活性比值超過(guò)10，以后繼續(xù)增加，但第29天時(shí)比值均開(kāi)始降低。高、中密度接種細(xì)胞分化而具有極化的速度快，而低密度接種則有利于細(xì)胞的分化。

2.4 酚紅透過(guò)率

隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞單層的酚紅透過(guò)率逐漸降低(表3)。高密度接種第9天、中密度接種第12天和低密度接種第15天，酚紅透過(guò)率均小于0.5%，并在所測(cè)定的接種第23天保持不透過(guò)性。

表1 Caco-2細(xì)胞單層TEER值與時(shí)間的關(guān)系(n=4)

注：A,B,C,D,E,F,G,H,I同一行中具有不同上標(biāo)數(shù)值間差異顯著(P<0.01)，a,b,c同一列中具有不同上標(biāo) 數(shù)值間差異顯著(P<0.01)。以下同。

表2 Caco-2細(xì)胞單層上下側(cè)堿性磷酸酶活性比值與時(shí)間的關(guān)系(n=4)

表3 Caco-2細(xì)胞單層酚紅透過(guò)率與時(shí)間的關(guān)系(n=4)

3 討 論

Caco-2細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能進(jìn)行形態(tài)和功能上的分化，在結(jié)構(gòu)和功能上與小腸上皮細(xì)胞很相似，被認(rèn)為是研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)腸道吸收最好的細(xì)胞模型之一。細(xì)胞層的緊密連接與跨上皮細(xì)胞TEER值具有密切相關(guān)，TEER值越大，說(shuō)明細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密性越好，細(xì)胞緊密連接越強(qiáng)。Ranaldi等[15]的研究結(jié)果表明，Caco-2細(xì)胞隨著培養(yǎng)條件的變化，其極化后的細(xì)胞層TEER值范圍在500～1 500 Ω·cm2之間。查龍應(yīng)[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TEER值達(dá)到620 Ω·cm2時(shí)，Caco-2細(xì)胞完成極化狀態(tài)。本次試驗(yàn)中，高密度接種第12天、中密度接種第15天和低密度接種第18天TEER值都能達(dá)到600 Ω·cm2以上，以后趨于穩(wěn)定，說(shuō)明細(xì)胞單層完成極化狀態(tài)。高密度接種在第25天、中密度接種和低密度接種在第7天以后TEER值下降，說(shuō)明細(xì)胞單層開(kāi)始去極化。

堿性磷酸酶是小腸刷狀緣細(xì)胞的標(biāo)志性酶，細(xì)胞在生長(zhǎng)至一定階段后，腸腔側(cè)堿性磷酸酶活性明顯提高，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)已經(jīng)具有了極性。查龍應(yīng)[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Caco-2細(xì)胞被接種于聚碳酯微孔濾膜21天后，細(xì)胞層AP側(cè)堿性磷酸酶活性是BP側(cè)的10倍之多。本次試驗(yàn)條件下研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)6天以后，細(xì)胞層AP側(cè)ALP活性顯著高于BL側(cè)，培養(yǎng)至第21天以后，AP側(cè)是BL側(cè)10倍以上，這說(shuō)明堿性磷酸酶已經(jīng)在刷狀緣側(cè)聚集，細(xì)胞單層達(dá)到極化狀態(tài)。第29天堿性磷酸酶活性開(kāi)始下降，說(shuō)明細(xì)胞單層開(kāi)始去極化。

苯酚紅為水溶性小分子物質(zhì)，不易被腸粘膜代謝且不會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，可以間接反應(yīng)單層細(xì)胞之間緊密連接處的通透量，作為細(xì)胞單層完整性的標(biāo)示物。因此本試驗(yàn)采用苯酚紅做為探針?biāo)幬镌u(píng)價(jià)在插槽內(nèi)培養(yǎng)的Caco-2單層細(xì)胞膜的完整性。苯酚透過(guò)率小于0.5%為細(xì)胞單層形成的標(biāo)志[14]。During等[12]細(xì)胞接種密度為6×104cells·cm-2接種到Transwell 6孔板上，21天后酚紅透過(guò)率接近于0。本次試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高密度接種在第9天、中密度接種在第12天、低密度接種在第15天時(shí)苯酚透過(guò)率小于0.5%，接種密度越大細(xì)胞融合成單層越快。

細(xì)胞模型構(gòu)建時(shí)間與細(xì)胞接種密度直接相關(guān)。Hilgers等[16]以6×104cells·cm-2的接種密度接種Caco-2細(xì)胞到Transwell 6孔板上，電鏡下觀察，第4天細(xì)胞融合，第7天細(xì)胞相連，第10天出現(xiàn)成熟的微絨毛，第14天細(xì)胞開(kāi)始分泌糖原顆粒，第21天細(xì)胞開(kāi)始深入插槽微孔膜的孔中，第28天插槽微孔膜的接受側(cè)也出現(xiàn)堿性磷酸酶，細(xì)胞出現(xiàn)去極化現(xiàn)象。Hunter等[7]以7×105cells·cm-2接種密度細(xì)胞接種Caco-2細(xì)胞到Transwell 6孔板上時(shí), 接種后第14～15天跨膜電阻值大于300 Ω·cm2用于吸收轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。Cavet等[8]以(4.4～5.0)×105cells·cm-2的接種密度接種Caco-2細(xì)胞到Transwell 6孔板上，第14～21天細(xì)胞單層膜跨膜電阻值達(dá)到200～300 Ω·cm2時(shí)，細(xì)胞單層模型用于藥物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。本次試驗(yàn)TEER值、ALP活性和酚紅透過(guò)率等3個(gè)指標(biāo)，高密度接種第15天時(shí)，酚紅透過(guò)率小于0.5%，ALP活性AP/BP側(cè)為10倍以上，TEER值已達(dá)到600 Ω·cm2以上；中密度接種第18天時(shí)，酚紅透過(guò)率小于0.5%，ALP活性AP/BP側(cè)為10倍以上，TEER值已達(dá)到600 Ω·cm2以上；低密度接種第21天時(shí)，酚紅透過(guò)率小于0.5%，ALP活性AP/BP側(cè)為10倍以上，TEER值已達(dá)到600 Ω·cm2以上。所有接種密度第29天TEER值和ALP活性均降低，因此不再適用于吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Effects of Cell Density on Differentiation and Depolarization of Caco-2 Cell Monolayers

(1 College of Animal Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600; 2 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences；China)

In order to investigate the effects of cell density on differentiation and depolarization of Caco-2 cell monolayer and determine the optimal time for absorption and transport experiment, the Caco-2 cells were inoculated at a density of 1×105(high, H), 5×104(medium, M) or 3×104(low, L) cells·cm-2on six-well transwell plates and cultured for 29 days. The transepithelial electrical resistance (TEER), alkaline phosphatase activities of apical side and basolateral side, and diffusion of phenol red were measured to evaluate the integrity and permeability of cell monolayers. The results showed that the TEER value exceeded 600 Ω·cm2at 12 d, 15 d and 18 d, and decreased at 27 d, 29 d and 29 d when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. The ratios of alkaline phosphatase activities of apical side to basolateral side were more than 10 at 15 d, 18 d and 21 d when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. The diffusions of phenol red from the apical side to the basolateral side were lower than 0.5% at 9 d, 12 d and 15 d when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. According to the above three indexes, the Caco-2 cell monolayers were satisfactory from 15 d, 18 d and 21 d for absorption and transport experiment when the cells were inoculated at a density of H, M or L, respectively. The Caco-2 cell monolayers more than 27 d were no longer suitable for absorption and transport experiment because of their lower vitality.

Caco-2 cell;transepithelial electrical resistance;alkaline phosphatase;phenol red

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.03.011

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：31272465)。

2016-04-27; 修改稿收到日期: 2016-06-25

R329.2+7

A

1672-7983(2016)03-0066-05

唐家明(1988-)，男，碩士研究生。主要研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理。

*通訊作者，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：家禽礦物元素營(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)。E-mail：wlysz@263.net。

**通訊作者，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理。E-mail：lisufen88@aliyun.com。