王秀平，齊慧霞，溫曉蕾

(河北科技師范學院生命科技學院，河北 秦皇島，066600)

氧化石墨烯對葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和炭疽病菌(Colletortrichumgloeosporioides)的離體抑菌活性*

王秀平，齊慧霞，溫曉蕾

(河北科技師范學院生命科技學院，河北 秦皇島，066600)

為確定氧化石墨烯對葡萄灰霉病和炭疽病的離體抑菌活性，將氧化石墨烯配制成50，100，250，500 mg/L的溶液，進行了氧化石墨烯對菌絲生長、病菌分生孢子產(chǎn)量及萌發(fā)、病菌菌絲生物產(chǎn)量等影響的試驗。結(jié)果表明，氧化石墨烯對葡萄灰霉病和炭疽病的菌絲生長速率、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量及生物產(chǎn)量具有顯著的抑制作用。在處理7 d后，各質(zhì)量濃度的氧化石墨烯處理對菌絲生長的影響與對照相比差異不顯著。氧化石墨烯對葡萄炭疽病菌絲的抑制作用明顯高于對葡萄灰霉病菌絲的抑制作用；對葡萄炭疽病孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量的抑制作用明顯高于對葡萄灰霉病孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量的抑制作用。

氧化石墨烯；葡萄炭疽??；葡萄灰霉病；離體抑菌活性

2004年,英國Manchester大學A K Geim和K S Novoselo發(fā)現(xiàn)石墨烯(graphene)以來，石墨烯被稱為納米材料中的一顆“新星”[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯(graphene oxide, GO)對大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonaaeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus) 均具有較好的殺菌活性[2]。此外，GO對植物病原細菌水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和對銅制劑產(chǎn)生抗性的茄科青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)具有較好的殺菌活性[3]。因此，GO作為殺菌材料在植物病害防治領域已展示出誘人的應用前景。

在植物病害種類中，有80%的病害由植物病原真菌引起。然而GO對植物病原真菌的殺菌活性還處于初步研究階段。為此，筆者進行了GO對葡萄炭疽病(Colletortrichumgloeosporioides)和葡萄灰霉病(Botrytiscinerea)的殺菌活性試驗，以期為氧化石墨烯在植物真菌性病害上的防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗方法

1.1 材料

GO合成參考Wang等[3]方法進行。試驗所用藥品雙氧水、高錳酸鉀、石墨粉、過硫酸鉀、濃硫酸、鹽酸均為分析純(AR)，引自國藥集團化學試劑有限公司。GL-21M型高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司生產(chǎn)；DZF-6020真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司生產(chǎn)；KQ-300DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司生產(chǎn)；Aquapro超純水機，美國Aquapro公司生產(chǎn)。具體合成步驟如下：稱取3 g石墨粉，2.5 g過硫酸鉀和2.5 g P2O5加入80 ℃濃硫酸中，攪拌4.5 h后冷卻到室溫，用0.5 L蒸餾水稀釋，放置過夜過濾后用去離子水沖洗，50 ℃烘干得到氧化石墨粉末。將氧化石墨粉加入120 mL 冰浴濃硫酸中，加入15 g高錳酸鉀，在35 ℃下攪拌2 h，加入250 mL去離子水后，攪拌2 h后再加入0.7 L去離子水，再加入20 mL體積分數(shù)為0.30的雙氧水(H2O2)，混合液變?yōu)樽攸S色?；旌先芤河? LV(H2O)∶V(HCl)=1∶9溶液沖洗，去除溶液中的金屬離子，再用去離子水洗至中性后過濾，得到的粉末在50 ℃真空烘箱中烘干，得到氧化石墨。配制質(zhì)量分數(shù)為0.005的氧化石墨分散液，超聲30 min后，透析7 d，后再抽濾得到片層厚度1～5 μm的氧化石墨烯。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉10～15 g，蒸餾水1 000 mL)。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種分離與保存 葡萄灰霉病菌B.cinerea和葡萄炭疽病C.gloeosporioides采自中糧華夏(秦皇島)長城葡萄酒有限公司葡萄種植基地，按常規(guī)方法在PDA培養(yǎng)基上繁殖培養(yǎng)并于4 ℃斜面保存。

1.2.2 GO對病菌菌絲生長的影響 將分離純化所得菌株在25 ℃下，PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，用打孔器在菌落邊緣制成直徑0.5 cm的菌餅，分別接種于含有50，100，250，500 mg/L GO的培養(yǎng)基上，對照加相同體積的無菌水。將接種后的培養(yǎng)基在25 ℃培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理5次重復，計算各濃度處理下GO對菌絲生長的抑制率[4]。

菌絲生長抑制率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%

1.2.3 GO對病菌分生孢子產(chǎn)量及萌發(fā)的影響 選擇直徑為1 cm的葡萄炭疽病和葡萄灰霉病菌餅5個(菌餅的培養(yǎng)條件及生理條件相對一致，對菌餅產(chǎn)孢量進行了初步的測定，結(jié)果表明PDA培養(yǎng)5 d后的外緣菌餅的產(chǎn)孢量基本一致)，分別放入盛有100 mL液體培養(yǎng)基(PD)的三角瓶中，置于溫度25 ℃，120 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)5 d后，將培養(yǎng)液用雙層紗布過濾，將濾液在5 000 r/min下離心10 min，去掉上清液，反復離心3次，以便去掉雜質(zhì)，將孢子加入收集濾液體積相等的無菌水，在顯微鏡下計算孢子的數(shù)量。將孢子懸浮液調(diào)整為1×108個/L的孢子懸浮液，將GO與孢子懸浮液混合制成使GO的最終質(zhì)量濃度為50，100，250，500 mg/L的溶液，取60 μL滴于雙凹片中，用無菌水與孢子懸浮液混配為對照，每個處理5次重復，10 h后，在10×10倍鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，并計算孢子萌發(fā)率[5]。

孢子萌發(fā)率=(發(fā)芽孢子的數(shù)量/孢子總數(shù))×100%

1.2.4 GO對病菌菌絲生物產(chǎn)量的影響 選擇直徑1 cm的葡萄炭疽病和葡萄灰霉病菌餅(菌餅的培養(yǎng)條件及生理條件相對一致，對菌餅產(chǎn)孢量進行了初步的測定，結(jié)果表明PDA培養(yǎng)5 d后的外緣菌餅的產(chǎn)孢量基本一致)，分別放入不同質(zhì)量濃度GO(50，100，250，500 mg/L)液體培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個質(zhì)量濃度設置3個重復。設無菌水為對照，在25 ℃，120 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)7 d后，將三角瓶內(nèi)的菌絲倒在紗布上，用無菌水沖洗留下的菌絲使之去掉雜質(zhì)，然后在50 ℃下烘干，烘至恒質(zhì)量。冷卻，稱質(zhì)量，計算菌絲生物量[6]。

菌絲生物量(g/L)=菌絲體干質(zhì)量/培養(yǎng)液體積

2 結(jié)果與分析

2.1 GO對葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌絲生長的影響

2.1.1 GO對葡萄灰霉病病菌菌絲生長的影響 GO對葡萄灰霉病菌菌絲生長具有明顯的抑制作用(表1)。不同質(zhì)量濃度的GO處理3 d后對葡萄灰霉病菌菌絲生長抑制率分別是4.1%，10.1%, 11.2%和14.2%，隨著GO質(zhì)量濃度的增加，菌絲生長抑制率明顯增加。不同質(zhì)量濃度的GO處理5 d后，對葡萄灰霉病菌絲生長抑制率分別為4.8%,7.8%，8.7%,10.1%，特別是當GO質(zhì)量濃度為100 mg/L及以上時可以顯著的抑制灰霉病菌絲的生長。在處理7 d后，各質(zhì)量濃度的GO處理對菌絲生長的影響與CK相比差異不顯著。

2.1.2 GO對葡萄炭疽病菌菌絲生長的影響 不同質(zhì)量濃度的GO處理3 d后，對葡萄炭疽病菌菌絲生長抑制率分別是7%，10%,17%和18%(表2)。隨著GO質(zhì)量濃度的增加，菌絲生長抑制率明顯增加。不同質(zhì)量濃度的GO處理5 d后，對葡萄炭疽病菌菌絲生長抑制率分別為9%,18%，20%,25%，特別是當GO質(zhì)量濃度為100 mg/L及以上時，可以顯著的抑制炭疽病菌絲的生長。不同質(zhì)量濃度的GO處理7 d后，對葡萄炭疽病菌菌絲生長抑制率分別為5%,14%，19%,27%，GO仍可以顯著的抑制炭疽病菌絲的生長。此外，GO對葡萄炭疽病菌絲生長的影響顯現(xiàn)一定的劑量效應。隨著GO質(zhì)量濃度的升高，GO對炭疽病菌絲生長的抑制作用越明顯。GO對葡萄炭疽病菌絲的抑制作用明顯高于對葡萄灰霉病菌絲的抑制作用(表1，表2)。

表1 GO對葡萄灰霉病菌菌絲生長的抑制率 %

注：表中不同小寫字母表示不同處理間數(shù)據(jù)有顯 著差異(P=0.05)，以下各表同。

表2 GO對葡萄炭疽病菌菌絲生長的抑制率 %

2.2 GO對葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的影響

2.2.1 GO對葡萄灰霉病菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的影響 不同濃度的GO對葡萄灰霉病菌孢子萌發(fā)的影響差異顯著，并表現(xiàn)出明顯的劑量效應(表3)。CK的孢子萌發(fā)率為70.8%，而不同質(zhì)量濃度的GO處理后，葡萄灰霉病孢子的萌發(fā)率分別為61.6%，49.6%，40.4%和36.6%，隨著GO質(zhì)量濃度的增加，孢子萌發(fā)率顯著的降低。此外，GO對葡萄灰霉病菌的產(chǎn)孢量也有明顯的抑制作用。在10×10的放大倍數(shù)下，CK平均每個視野的孢子數(shù)為47.2個，不同GO質(zhì)量濃度處理的每個視野的平均孢子數(shù)分別為39.1,31.3,25和17.2個，隨著GO質(zhì)量濃度的升高，葡萄灰霉病菌的產(chǎn)孢量明顯的降低。

2.2.2 GO對葡萄炭疽菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的影響 不同濃度的GO對葡萄炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響差異顯著，并表現(xiàn)出明顯的劑量效應(表4)。CK的孢子萌發(fā)率為90.8%，而不同質(zhì)量濃度的GO處理后，葡萄炭疽病孢子的萌發(fā)率分別為78.4%，51.2%，26%和24.4%，隨著GO質(zhì)量濃度的增加，孢子萌發(fā)率顯著的降低。此外，GO對葡萄灰霉病菌的產(chǎn)孢量也有明顯的抑制作用。在10×10的放大倍數(shù)下，CK平均每個視野的孢子數(shù)為388.3個，不同GO質(zhì)量濃度處理的每個視野的平均孢子數(shù)分別為132.63,44.88,14.38和5.25個，隨著GO質(zhì)量濃度的升高，葡萄灰霉病菌的產(chǎn)孢量明顯的降低。GO對葡萄炭疽病孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量的抑制作用明顯高于GO對葡萄灰霉病孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量的抑制作用(表3,表4)。

表3 GO對葡萄灰霉病孢子萌發(fā)率及產(chǎn)孢量的影響

表4 GO對葡萄炭疽病菌孢子萌發(fā)率及產(chǎn)孢量的影響

2.3 GO對葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌絲生物產(chǎn)量的影響

2.3.1 GO對葡萄灰霉病菌菌絲生物產(chǎn)量的影響 不同質(zhì)量濃度的GO對葡萄灰霉病菌絲生物產(chǎn)量具有顯著的抑制作用(表5)。CK的菌絲生物產(chǎn)量為0.461 g，不同質(zhì)量濃度的GO處理后，菌絲生物產(chǎn)量分別為0.435，0.405，0.381，0.371 g，隨著GO質(zhì)量濃度的增加，葡萄灰霉病的菌絲生物產(chǎn)量顯著的降低。

2.3.2 GO對葡萄炭疽病菌絲生物產(chǎn)量的影響 不同質(zhì)量濃度的GO對葡萄炭疽病菌絲生物產(chǎn)量具有顯著的抑制作用(表6)。CK的菌絲生物產(chǎn)量為0.501 g，當GO的質(zhì)量濃度為50和100 mg/L時，葡萄炭疽病菌絲的生物產(chǎn)量與CK相比差異不顯著。當GO的質(zhì)量濃度增加到250 mg/L時，葡萄炭疽病菌絲的生物產(chǎn)量顯著的下降。

表5 GO對葡萄灰霉菌菌絲生物產(chǎn)量的影響

表6 GO對葡萄炭疽病菌菌絲生物產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論與討論

由于我國大多數(shù)葡萄栽培地區(qū)連年種植使病原菌菌源積累，從而造成葡萄兩種病害逐年加重，目前已成為葡萄生產(chǎn)上的主要病害[7,8]?；瘜W防治是控制葡萄炭疽病和灰霉病的主要防治措施，但是防治方法單一，防治適期和方法不當及病原菌抗藥性等問題，防治效果較差。目前，已有報道防治葡萄灰霉病和炭疽病常用的化學農(nóng)藥如百菌清和多菌靈已經(jīng)產(chǎn)生了嚴重的抗藥性[9]，因此葡萄炭疽病和灰霉病的防治和病原菌的抗藥性問題已經(jīng)引起了植保工作者的高度關注。

本次研究結(jié)果表明，GO對葡萄灰霉病和炭疽病的菌絲生長速率、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量及菌絲生物產(chǎn)量均有顯著的抑制作用，GO對葡萄炭疽病菌絲生長、孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量的抑制作用明顯高于GO對葡萄灰霉病菌絲生長、孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量的抑制作用。GO對葡萄灰霉病和炭疽病的防治具有潛在的應用前景，但由于受很多因素的影響，室內(nèi)的抑菌活性和在田間使用上的效果不一定完全一致，因此本研究的結(jié)果還有待于在田間進一步開展藥劑防治試驗。此外，GO對葡萄炭疽病和灰霉病的殺菌機制還有待于進一步的研究。

[1] Geim A K,Novoselov K S.The rise of graphene[J].Nature Materials,2007,6(3):183-191.

[2] Liu S,Zeng T H,Hofmann M,et al.Antibacterial Activity of Graphite, Graphite Oxide, Graphene Oxide, and Reduced Graphene Oxide:Membrane and Oxidative Stress[J].American Chemical Society Nano,2011,5(9):6 971-6 980.

[3] Wang X P,Liu X Q,Han H Y.Evaluation of antibacterial effects of carbon nanomaterials against copper-resistantRalstoniasolanacetum[J].Colloids and surfaces B Biointerfaces,2013,103(2):136-142.

[4] 慕立義.植物化學保護研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1994.

[5] 孫家隆,慕衛(wèi).農(nóng)藥學實驗技術與指導[M].北京：化學工業(yè)出版社,2009.

[6] 王振河,武忠偉,趙現(xiàn)方,等.營養(yǎng)物質(zhì)對桑黃菌絲生物量及胞外多糖產(chǎn)量的影響[J].中國野生植物資源, 2009, 28(1):37-40,52.

[7] 陳宏州,楊敬輝,肖婷,等.12種殺菌劑對葡萄灰霉病菌的毒力測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2015,43(1):124-127.

[8] 楊敬輝,陳宏州,肖婷,等.14種殺菌劑對葡萄炭疽病菌的毒力測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(12):163-166.

[9] 李洋,劉長遠,陳秀蓉,等.遼寧省葡萄炭疽菌鑒定及對多菌靈敏感性研究[J].植物保護,2009,35(4):74-77.

(責任編輯：朱寶昌)

Antifungal Activities of Graphene Oxide Against Grape Grey Mold and Grape Anthracnoseinvitro

WANG Xiuping, QI Huixia, WEN Xiaolei

(College of Life Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600, China)

In order to determine the antibacterial activities of graphene oxide against grape grey mold and grape anthracnose, the effects of graphene oxide solution (50, 100, 250, 500 mg/L) on growth rate of mycelium, spore germination, amount of spore production and biological yield of grape grey mold and grape anthracnose were testedinvitro. The results showed that the growth rate of mycelium, spore germination, amount of spore production and biological yield of grape grey mold and grape anthracnose were significantly inhibited by graphene oxide. After 7-day treatment with graphene oxide, no significant differences in mycelial growth of grape grey mold and grape anthracnose were found. The inhibitory effects of graphene oxide on growth rate of mycelium, spore germination and amount of spore production of grape anthracnose were obviously higher than those of graphene oxide on grape grey mold.

graphene oxide; grape anthracnose; grape grey mold; antifungal activityinvitro

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.03.008

國家自然科學基金項目(項目編號：31501680)，河北省自然科學基金項目(項目編號：C2014407061)，河北科技師范學院博士啟動基金項目(項目編號：2013YB005)。

2016-09-23

S436.631.1+2

A

1672-7983(2016)03-0045-04

王秀平(1980-)，女，講師，博士。主要研究方向：納米農(nóng)藥的合成與應用。