于　濤，吳　彪，楊愛國(guó)，周麗青，劉志鴻

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櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子代線粒體COI和Cytb基因遺傳多樣性分析

于濤1，吳彪2，楊愛國(guó)2，周麗青2，劉志鴻2

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)島增殖實(shí)驗(yàn)站，山東 煙臺(tái) 265800； 2.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071）

摘要：為了解櫛孔扇貝（Chlamys farreri）、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）及其雜交子代（F1）的種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)3個(gè)群體的線粒體COI和Cytb基因的部分序列進(jìn)行了擴(kuò)增和分析。經(jīng)比對(duì)分別獲得781bp和725bp核苷酸片段，74個(gè)樣本共檢測(cè)到47個(gè)單倍型； F1群體的單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)都是最高的，而雙親的較低； F1和櫛孔扇貝間的遺傳距離最小，其次為櫛孔扇貝和蝦夷扇貝群體之間，F(xiàn)1和蝦夷扇貝群體之間的遺傳距離最大； F1和櫛孔扇貝之間的遺傳分化系數(shù)較小而兩者間的基因流比較大，F(xiàn)1和櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳分化系數(shù)較大而基因流較小，說明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝群體群體很早就發(fā)生了遺傳分化； 采用 UPGMA法和簡(jiǎn)化的中介網(wǎng)絡(luò)法構(gòu)建的系統(tǒng)樹表明，3個(gè)群體的所有個(gè)體被分為2個(gè)族群，櫛孔扇貝和F1交叉聚為一類，蝦夷扇貝獨(dú)自聚為一類，2個(gè)分支間沒有交叉； 使用特異性引物分別對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)，結(jié)果櫛孔扇貝的特異引物能在雜交子代中擴(kuò)增，而蝦夷扇貝的特異引物不能在子代中擴(kuò)增出條帶，說明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交，其子代的線粒體遺傳模式為嚴(yán)格的母系遺傳。本研究結(jié)果表明雜種優(yōu)勢(shì)的形成與線粒體遺傳多樣性的變化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：COI； Cytb； 櫛孔扇貝； 蝦夷扇貝； F1； 遺傳多樣性

［Foundation： Supported by the earmarked fund for modern agroindustry technology research system］

櫛孔扇貝（Chlamys farreri）是我國(guó)北方海水傳統(tǒng)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)貝類，蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是原產(chǎn)于日本、俄羅斯遠(yuǎn)東及朝鮮部分水域的冷水性貝類，20世紀(jì)80年代引入中國(guó)。針對(duì)20世紀(jì)90年代以來扇貝在夏季高溫季節(jié)大規(guī)模死亡的現(xiàn)象，自 2000年開始，黃海水產(chǎn)研究所貝類研究實(shí)驗(yàn)室開展了櫛孔扇貝（♀）與蝦夷扇貝（♂）遠(yuǎn)緣雜交的研究，雜交子代外形偏向母本，但和母本相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)［1］。

線粒體（mitochondria）是細(xì)胞內(nèi)呼吸的場(chǎng)所，與細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受精、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老、凋亡等有密切關(guān)系［2］，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是動(dòng)物細(xì)胞中唯一存在于核外的遺傳物質(zhì)［3］，其分子質(zhì)量小，為共價(jià)閉合的環(huán)狀分子，具有較高突變率，突變固定后形成的多態(tài)位點(diǎn)可反映出群體遺傳結(jié)構(gòu)、種群分化和種屬關(guān)系等特點(diǎn)［4］。絕大多數(shù)生物的線粒體遺傳模式為母系遺傳［5］，即使在不同種間的雜交研究中，仍遵循母系遺傳，徐冬冬［6］研究了褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）和夏牙鲆（P.dentatus）雜交及回交子代的線粒體遺傳模式，徐?。?］分析了對(duì)櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝（Chlamys nobilis）及其雜交子代線粒體遺傳模式，結(jié)果都表明子代線粒體與母本完全相同，說明在雜交過程中線粒體遵循母系遺傳的方式。但近年來對(duì)一些雙殼貝類的研究表明［8］，線粒體基因組不完全遵循母性遺傳，而是雙單性遺傳（doubly uniparental inheritance，DUI）。

滕麗麗［9］利用16S rRNA研究了櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交其雜交子代的線粒體遺傳模式，結(jié)果證明為嚴(yán)格的母系遺傳。一般16S rRNA基因比較保守，進(jìn)化速率較低，而細(xì)胞色素氧化酶 I亞基（cytochrome oxidase subunit I，COI）和細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）則變異較大，進(jìn)化速度適中，可提供豐富的DNA多態(tài)信息，是研究種間、種內(nèi)分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育最有用的基因之一［10-11］。本文首先通過對(duì)COI、Cytb基因的擴(kuò)增進(jìn)一步確定櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交其雜交子代的線粒體遺傳模式； 同時(shí)，分析了3個(gè)群體線粒體的遺傳多樣性水平，探討了線粒體在雜種優(yōu)勢(shì)表達(dá)過程中的作用，豐富了雜種優(yōu)勢(shì)遺傳機(jī)理研究的內(nèi)容。

1　材料與方法

1.1材料

櫛孔扇貝（♀）與蝦夷扇貝（♂）均取自山東長(zhǎng)島海區(qū)，經(jīng)雜交產(chǎn)生 F1代； 取親貝閉殼肌、雜交子代的 D型幼蟲用于實(shí)驗(yàn)，閉殼肌于-80℃保存?zhèn)溆?，酒精固定幼蟲，-20℃保存?zhèn)溆?。閉殼肌DNA 的提取采用酚-氯仿法進(jìn)行［12］； D型幼蟲 DNA 的提取參照萬(wàn)俊芬等［13］的方法進(jìn)行。每個(gè)群體分別取30個(gè)個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2PCR擴(kuò)增

COI 基因擴(kuò)增引物序列為： F-GGTCAACAAAT CATAAAGATATT GG（5′-3′），R-TAAACTTCAGGGT GACCAAAAAATCA（5′-3′）； Cytb 基因擴(kuò)增引物序列為： F-TACCATGAGGACAA ATATCATTCTG（5′-3′），R-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG（5′-3′）。

PCR擴(kuò)增體系為 50uL： 模板 DNA50ng、Taq DNA Polymerase 1 U（Tiangen）、1×buffer、2mmol/L Mg2+、引物分別為0.2umol/L、0.2mmol/L的dNTP，超純水補(bǔ)至 50uL。優(yōu)化后的反應(yīng)程序： 94℃預(yù)變性5min； 94℃變性45s，48℃（COI）/50℃（Cytb）退火1min，72℃延伸1min共35個(gè)循環(huán)； 72℃延伸5min。

1.3PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序

1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DL2000 Marker確定條帶大小，進(jìn)行切膠、回收、純化（Zymoclean?Gel DNA Recovery Kit）。純化后的PCR 產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序，所用測(cè)序儀器為 ABI PRISM 3730，測(cè)序試劑為BigDyeterminator v3.1。

1.4數(shù)據(jù)分析

參考呂振明［14］的分析方法，序列采用 Clustal 1.83軟件進(jìn)行編輯、排序和校對(duì)； 采用DNAsp 5.10軟件對(duì)單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)（H）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）等遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計(jì)算； 采用MEGA 4.0.2軟件計(jì)算遺傳距離和聚類分析，系統(tǒng)發(fā)生樹采用UPGMA模型進(jìn)行構(gòu)建；采用簡(jiǎn)化的中介網(wǎng)絡(luò)法［15］構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖；用Arlequin3.5軟件計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)Fst及顯著性（重復(fù)次數(shù) 1000次），群體間基因流 Nm由公式Nm=（1-Fst）/2 Fst計(jì)算而得。

1.5特異性引物驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證是否有少量的父本線粒體基因滲入子代，參照徐?。?］的方法，根據(jù)測(cè)序所得櫛孔扇貝、蝦夷扇貝COI和Cytb基因序列以及二者的差異片段，利用Primer 5設(shè)計(jì)各自特異的引物，然后利用特異性引物分別對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系、程序、檢測(cè)方法同上。特異性引物序列見表1。

2　結(jié)果

2.1擴(kuò)增結(jié)果及堿基組成

序列經(jīng)Clustal 對(duì)位排序、校對(duì)后，得到櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子代的COI和Cytb基因序列。3個(gè)群體的COI基因序列長(zhǎng)度為781bp，與Genebank（櫛孔扇貝： EU715252.2，蝦夷扇貝： AB271769.1）中已有的序列進(jìn)行比對(duì)，同源率都達(dá)到 99%，其中雜交子代和母本櫛孔扇貝的序列一致，為母系遺傳。櫛孔扇貝、雜交子一代的堿基A、T、G、 C和A+T 含量分別為19.7%、40.5%、23.8%、16.0%和60.2% ； 蝦夷扇貝的堿基 A、T、G、 C和 A+T 含量分別為19.3%、36.2%、25.2%、19.3%和55.5%。3個(gè)群體的Cytb基因序列長(zhǎng)度為725bp，與Genebank（櫛孔扇貝：EU715252.2，蝦夷扇貝： AB271769.1）中已有的序列進(jìn)行比對(duì)，同源率也都達(dá)到 99%，雜交子代和母本櫛孔扇貝的序列也一致，同樣說明為母系遺傳，櫛孔扇貝、雜交子一代的堿基A、T、G、 C和A+T 含量分別為23.6%、36.9%、26.1%、13.4%和60.5% ； 蝦夷扇貝的堿基 A、T、G、 C和 A+T 含量分別為17.7%、35.2%、27.8%、17.3%和 54.9%，通過比較看出，櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交，其雜交子代線粒體的遺傳模式為嚴(yán)格的母系遺傳。

表1　特異性引物序列及其退火溫度Tab.1　Sequences and annealing temperatures of the primers

圖1　櫛孔扇貝與蝦夷扇貝線粒體COI 和Cytb基因片段核苷酸序列Fig.1　Nucleotide sequences of COI and Cytb gene fragments of Chlamys farreri and Patinopecten yessoensis

2.2基因多態(tài)性分析

3個(gè)扇貝群體2種線粒體基因片段的遺傳多樣性參數(shù)如表2所示。從單倍型參數(shù)看，雜交子代群體的單倍型數(shù)及單倍型多樣性指數(shù)最高，分別為11、8和0.914±0.00313、0.956±0.00353，雙親的單倍型及其多樣性指數(shù)相近； 在核苷酸參數(shù)中，雜交子代群體的核苷酸多樣性依舊是最高的，分別為 0.00551± 0.00630和 0.00508±0.00601，其次為蝦夷扇貝群體，最低為櫛孔扇貝群體； 平均核苷酸差異數(shù)仍是雜交子代的最高，雙親的最低。從以上結(jié)果可以看出，雜交子代群體的遺傳多樣性較雙親的有所提高。

2.3群體遺傳分化和聚類分析

利用MEGA軟件中的Kimura 2-paramter 雙參數(shù)模型對(duì)上述3個(gè)群體進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，COI和Cytb結(jié)果相似，雜交子代和櫛孔扇貝間的遺傳距離最小為0.004261、0.005625，其次為櫛孔扇貝和蝦夷扇貝群體之間，為0.7463、0.9971，遺傳距離最大的是雜交子代和蝦夷扇貝群體之間，為 0.7501、0.9991。這表明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝很早就出現(xiàn)了分化，同時(shí)也表明，二者的雜交子代的線粒體遺傳模式為母系遺傳。

表2　3個(gè)扇貝群體的遺傳變異參數(shù)Tab.2　Genetic variation parameters of three scallop populations

COI和 Cytb基因流（Nm）和遺傳分化系數(shù)（Fst）分析結(jié)果也相似，雜交子代和櫛孔扇貝之間的遺傳分化系數(shù)較小，基因流則比較大，而雜交子代和櫛孔扇貝與蝦夷扇貝之間的遺傳分化系數(shù)較大，基因流較小。說明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝群體很早就發(fā)生了遺傳分化，具體結(jié)果見表3。

表3　3個(gè)扇貝群體間的遺傳分化和基因流Tab.3　Genetic divergence and gene flow between three scallop populations

采用UPGMA 法構(gòu)建3個(gè)群體2種基因的系統(tǒng)樹，并對(duì)各分支均進(jìn)行 1000 次的重復(fù)檢驗(yàn)，2個(gè)系統(tǒng)樹結(jié)果相似，見圖3。3個(gè)群體的所有個(gè)體被分為 2個(gè)族群，櫛孔扇貝和雜交子代交叉聚為一類，蝦夷扇貝獨(dú)自聚為一類，2個(gè)分支間沒有交叉。采用簡(jiǎn)化的中介網(wǎng)絡(luò)法對(duì)各類群?jiǎn)伪缎途W(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖進(jìn)行構(gòu)建，結(jié)果也支持聚類分析結(jié)果。如圖 2所示，網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中櫛孔扇貝和雜交子代的單倍型聚為一支，而蝦夷扇貝的單倍型獨(dú)自聚為另一支。

圖2　3個(gè)扇貝群體單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2　Reduced median network of haplotypes showing genetic relationship between three scallop populations

2.4特異引物擴(kuò)增結(jié)果

使用特異性引物分別對(duì)櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子代進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)。COI-C、Cytb-C2對(duì)引物能選擇性的擴(kuò)增櫛孔扇貝的COI和Cytb部分片段，分別得到大小約為 450bp和 520bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，在蝦夷扇貝中則無擴(kuò)增產(chǎn)物。引物 COI-P、Cytb-P則能選擇性的擴(kuò)增蝦夷扇貝的COI和Cytb部分片段，分別得到約450bp和520bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，而在櫛孔扇貝中無擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖4。用各自的特異引物對(duì)雜交子代進(jìn)行擴(kuò)增，得出的結(jié)果和在櫛孔扇貝中的一致，櫛孔扇貝的特異引物能在雜交子代中擴(kuò)增，而蝦夷扇貝的特異引物不能在子代中擴(kuò)增出條帶（圖4），說明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交，其子代的線粒體遺傳模式為嚴(yán)格的母系遺傳。

3　討論

3.1櫛孔扇貝與蝦夷扇貝雜交

楊愛國(guó)［1］以櫛孔扇貝與蝦夷扇貝作親本，進(jìn)行了正反交實(shí)驗(yàn)，雜交后代在同一海區(qū)進(jìn)行了養(yǎng)殖試驗(yàn)。結(jié)果表明，水溫15～18℃條件下，正、反交均可正常受精，受精率在 90%以上，與對(duì)照組沒有明顯差別； 成體的外部形態(tài)與母本基本相同，是偏向母本類型的異源二倍體； 正交組在第 2年高水溫季節(jié)櫛孔扇貝出現(xiàn)大量死亡的情況下，成活率達(dá) 95%，生長(zhǎng)速度提高 23%，反交組在苗種中間暫養(yǎng)和養(yǎng)殖過程中的成活率比蝦夷扇貝提高 16%，生長(zhǎng)速度未見顯著差別； 正、反交子一代生殖腺發(fā)育正常，可排放精、卵。試驗(yàn)證明，櫛孔扇貝（♀）×蝦夷扇貝（♂）的雜交子一代，外部形態(tài)雖與櫛孔扇貝基本相同，但顯著提高了櫛孔扇貝的生產(chǎn)性能尤其是抗逆能力，遠(yuǎn)緣雜交育種是解決櫛孔扇貝大面積死亡的重要途徑之一，其雜交子一代已經(jīng)具有生產(chǎn)使用價(jià)值。

為驗(yàn)證雜交的雜交的真實(shí)性，周麗青［16］采用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)對(duì)櫛孔扇貝（♀）×蝦夷扇貝（♂）的精子人卵過程進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，這2種扇貝雜交與親本自交的精子人卵過程沒有本質(zhì)的區(qū)別。成熟的精卵相遇時(shí)，相互激活，產(chǎn)生一系列胞間反應(yīng)，卵子的激活集中表現(xiàn)為皮層反應(yīng)、受精膜舉起、成熟分裂重新啟動(dòng)； 精子激活集中表現(xiàn)為頂體反應(yīng)和受精錐形成。楊璞［17-18］采用SSR、RAPD 和GISH 技術(shù)對(duì)櫛孔扇貝（♀）和蝦夷扇貝（♂）雜交子代胚后發(fā)育，其中 SSR引物P13F449和KMY134的擴(kuò)增產(chǎn)物中可以明顯地分辨出來自父母本群體的特有條帶； 在 RAPD 檢測(cè)中，櫛孔扇貝的特異條帶和蝦夷扇貝特異條帶均能在后代中擴(kuò)增出來； GISH 結(jié)果也表明，雜交扇貝在擔(dān)輪幼蟲期和D 形幼蟲期均繼承了來自父母本遺傳物質(zhì)。

圖3　3個(gè)扇貝群體的UPGMA聚類分析Fig.3　UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）tree constructed from genetic distances among three scallop populations

3.2線粒體研究

線粒體DNA是動(dòng)物細(xì)胞中唯一存在于細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，其分子量小、為共價(jià)閉合的環(huán)狀分子、遺傳性穩(wěn)定、呈嚴(yán)格的母系遺傳、無組織特異性、進(jìn)化速度快，在群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、分子生態(tài)學(xué)等學(xué)科的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。秦芳［19］通過分析利川馬線粒體DNA Cytb基因全序列，發(fā)現(xiàn)所分析的群體遺傳多態(tài)性都較豐富； 呂振明［14］采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)青島、舟山、廈門和廣州 4個(gè)鰳地理群體的種群結(jié)構(gòu)及遺傳變異進(jìn)行研究，結(jié)果表明，中國(guó)現(xiàn)存鰳種群仍具較高的遺傳多樣性水平，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，青島群體與其他 3個(gè)群體間存在顯著的遺傳分化，推測(cè)青島群體的分化可能與晚更新世以來頻繁的海平面變化有關(guān)； 牟希東［20］將鯽魚和金魚線粒體 Cytb基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者同源性達(dá)97.9%，表明二者還在同一種的水平上。

本研究發(fā)現(xiàn)，雜交子代在單倍型多樣性、平均核苷酸多樣性等遺傳參數(shù)方面較父母本有所提高，原因可能是雜交的結(jié)果，在蝦夷扇貝的精子進(jìn)入櫛孔扇貝的卵子時(shí)，除了核DNA進(jìn)入外還有其他物質(zhì)進(jìn)入了卵細(xì)胞，受精卵的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生很大變化，致使線粒體DNA處于一種新的體系中。同種生物其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境非常相似，基因間經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化，已達(dá)到一種平衡狀態(tài)，自交不會(huì)發(fā)生劇烈的變化，而當(dāng)近緣種或遠(yuǎn)緣種雜交時(shí)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生劇烈變化，出于本能兩套基因間會(huì)相互協(xié)調(diào)達(dá)到一種平衡，由于線粒體DNA的復(fù)制酶沒有校對(duì)能力和無核蛋白保護(hù)［21］，變異率本來就高，這就造成在某些位點(diǎn)可能發(fā)生了突變但沒有有效的損傷修復(fù)機(jī)制，突變就很容易固定了下來導(dǎo)致多樣性升高。Ladoukakis［22］在雙單性遺傳的貝類中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)和M線粒體DNA有重組現(xiàn)象發(fā)生，且其同源重組率的高低與雙親的線粒體的差異大小有關(guān)。

圖4　通用引物及特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4　Amplified results of the general and special primers

a、c： COI和Cytb通用引物在3個(gè)群體中的擴(kuò)增： 1～4為櫛孔扇貝，5～8為雜交子代，9～12為蝦夷扇貝。b、d： COI和Cytb特異性引物在3個(gè)群體中的擴(kuò)增： b（左）、d（左）為蝦夷扇貝的特異性引物在蝦夷扇貝（b1-b4，d7-d10）、櫛孔扇貝（b5-b7，d1-d3）及其雜交子代（a8-a10，d4-d6）中的擴(kuò)增結(jié)果； b（右）、d（右）為櫛孔扇貝的COI特異引物在櫛孔扇貝（b11-b13，d11-d14）、雜交子代（b14-b16，d15-d18）和蝦夷扇貝（b17-b20，d19-d22）中的擴(kuò)增結(jié)果

Fig a and c was the amplified results of the general primers in the three populations： 1-4 was Chlamys farreri，5-8 was the hybrid offspring，9-12 was Patinopecten yessoensis.Fig b and d was the amplified result of the special primers in the three populations： b（left）、d（left）was the amplified results of the P.yessoensis' special primers in P.yessoensis（b1-b4，d7-d10），C.farreri（b5-b7，d1-d3），the hybrid offspring（b8-b10，d4-d6）； b（right）、d（right）was the amplified results ofthe C.farreri's special primers in C.farreri（b11-b13，d11-d14），the hybrid offspring（b14-b16，d15-d18），P.yessoensis（b17-b20，d19-d22）.

3.3母系遺傳的研究

絕大多數(shù)生物的線粒體遺傳模式為母系遺傳，即后代雌雄性的線粒體DNA和母本一致。對(duì)褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）、夏牙鲆（P.dentatus）［6］、翡翠股貽貝（Perna viridis）［23］、櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝（Chlamys nobilis）［7］的研究表明，子代的線粒體類型都與母本完全相同，線粒體遵循母系遺傳的方式。但近年來，在貽貝科（Mytilus galloprovincialis、M.edulis、M.trossulus）、簾蛤科（Venerupis philippmarum、 Tapes philippinarum）、斧蛤科（Donax trunculus）、珍珠蚌科（Margaritifera hembeli）、河蚌科（Ligumia recta）等雙殼貝類的研究中［24］發(fā)現(xiàn)了雙單性遺傳（doubly uniparental inheritance，DUI）現(xiàn)象，即在雌性體內(nèi)只有一套線粒體DNA，和母體線粒體DNA一致，稱為F型線粒體基因組，而在雄性體內(nèi)則有兩套線粒體DNA，一套存在于身體的肌肉組織，與同代雌性個(gè)體和母本的 F型線粒體一致，而另一套則存在于雄性性腺中，稱為M型線粒體基因組，F(xiàn)型線粒體與M型線粒體基因序列有10%～30%的差異［25］。從本文的結(jié)果可以看到，櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交，其雜交子代的線粒體DNA和母本的相似性達(dá)到99.5%，且只有一套DNA序列，說明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交其子代的線粒體DNA的遺傳模式為嚴(yán)格的母系遺傳，這與滕麗麗［9］利用16S rRNA得出的結(jié)果一致。特異性引物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，櫛孔扇貝的特異性引物可以在櫛孔扇貝和雜交群體中擴(kuò)增出來，而不能在蝦夷扇貝群體中擴(kuò)增； 同樣，蝦夷扇貝的特異性引物可以在蝦夷扇貝擴(kuò)增出來，而不能在櫛孔扇貝和雜交群體中擴(kuò)增，進(jìn)一步證明櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交其子代的線粒體DNA的遺傳模式為嚴(yán)格的母系遺傳。

3.4細(xì)胞質(zhì)遺傳與雜種優(yōu)勢(shì)

滕麗莉［9］、何斌［26］、程寧寧等［27］利用 RAPD、ISSR、SRAP等技術(shù)研究了櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子一代的核遺傳物質(zhì)的多樣性水平，都得到類似的結(jié)果，即雜交子代群體的遺傳多樣性水平都升高，得出遺傳多樣性的升高對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的形成有一定的貢獻(xiàn)。群體遺傳多樣性水平是評(píng)價(jià)生物資源的重要指標(biāo)，與生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力、生長(zhǎng)速度、抗病能力等密切相關(guān)，是物種保持進(jìn)化潛能的基本條件，遺傳多樣性的升高將使物種表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性即表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)［28］。雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)涉及到各種基因之間、各種生理生化反應(yīng)之間以及遺傳物質(zhì)與環(huán)境之間的相互作用，因此僅僅從核基因角度來解釋雜種優(yōu)勢(shì)的形成顯然是不夠的，作為動(dòng)物細(xì)胞核外的唯一的遺傳物質(zhì)，線粒體DNA也應(yīng)該參與了雜種優(yōu)勢(shì)的形成。

本文利用COI和Cytb基因考察雜交子代線粒體DNA的遺傳多樣性水平，結(jié)果顯示，在單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)等多樣性指數(shù)方面得出的結(jié)果和對(duì)核基因研究得出的結(jié)果類似，即雜交子代的多樣性都比兩親本的都要高。遺傳多樣性的升高將使物種表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性即表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，核遺傳是這個(gè)原理，那么細(xì)胞質(zhì)的也應(yīng)該如此，線粒體遺傳多樣性的升高對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的形成也應(yīng)該有一定的作用。

Mcdaniel［29-30］等研究發(fā)現(xiàn)，雜種優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生與線粒體的活性有密切聯(lián)系，具有雜種優(yōu)勢(shì)的子代往往具有較高的線粒體活性； 鄭兢貴等［31］的研究表明，在超微結(jié)構(gòu)上，雜交子代的線粒體比親本的發(fā)達(dá)；Sarkissian［3］研究還發(fā)現(xiàn)，將兩親本的線粒體混合，混合后的線粒體的活性比任何一方的親本的都要高，但和子代的線粒體活性相當(dāng)。線粒體的遺傳模式為母系遺傳，父本的線粒體不能傳遞給后代，所以是父本的某些物質(zhì)進(jìn)入卵子，從而形成了一個(gè)全新的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致子代線粒體的變化，使其多樣性升高，多樣性升高的結(jié)果之一就是使線粒體的活性升高，類似結(jié)論在Sarkissian［30］的研究中也有發(fā)現(xiàn)，具有較高線粒體活性的雜交子代其線粒體的多態(tài)性也較高。

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（本文編輯： 梁德海）

Genetic diversity analysis of Chlamys farreri，Patinopecten yessoensis，and their offspring based on COI and Cytb sequences

YU Tao1，WU Biao2，YANG Ai-guo2，ZHOU Li-qing2，LIU Zhi-hong2
（1.Changdao Enhancement and Experiment Station，Chinese Academy of Fishery Science，Yantai 265800，China； 2.Key Laboratory for Sustainable Utilization of Marine Fisheries Resources，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China）

Received: Jul.11，2015

Key words:COI； Cytb； Chlamys farreri； Patinopecten yessoensis； F1； genetic diversity

Abstract:Mitochondrial DNA cytochrome oxidase subunit I（COI）and cytochrome b（Cytb）gene fragments were amplified and analyzed to examine the genetic diversity and structure of three scallop populations： Chlamys farreri，Patinopecten yessoensis，and their hybrid（F1）.Fragments with 781 bp of the partial COI gene and 725 bp of the partial Cytb gene were obtained after alignment and emendation，and 47 haplotypes were found in the sequences of the 74 samples.The genetic diversity indexes，including the haplotype number，haplotype diversity，nucleotide diversity，and average number of nucleotide differences，showed that the genetic diversity of F1was greater than that of the parents.The genetic distance between F1and C.farreri was the nearest and that between F1and P.yessoensis was the farthest.The level of gene flow between F1and P.yessoensis was less than the level between F1and C.farreri，while the population differentiation values between F1and P.yessoensis was greater than the value between F1and C.farreri，suggesting that the differentiation between C.farreri and P.yessoensis happened a long time ago.A UPGMA tree and reduced median network of haplotypes led to the same result，with the population of C.farreri and F1gathered together and the population of P.yessoensis gathered together independently.PCR reamplification revealed that the special primers of C.farreri could be amplified but the P.yessoensis special primers could not be amplified in the F1population，indicating that the mitochondrial DNA genetic model of F1represented matrilinear inheritance.

中圖分類號(hào)：S917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3096（2016）03-0001-09

doi：10.11759/hykx20141113002

收稿日期：2015-07-11； 修回日期： 2015-10-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：于濤（1985-），男，工程師，主要從事貝類遺傳育種和健康養(yǎng)殖研究，E-mail： cdyutao@126.com； 楊愛國(guó)（1957-），通信作者，男，研究員，電話： 0532-85811982，E-mail： yangag@ysfri.ac.cn