吳瓊　方吳云　王文杰

摘要 [目的]明確機(jī)械損傷對(duì)不同茶樹無性系品種葉片和新梢苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性及茶多酚含量的影響。[方法]以茶樹無性系良種舒茶早、鳧早2號(hào)、福鼎大白茶為試驗(yàn)材料，采用分光光度計(jì)法測(cè)定正常茶樹葉片中PAL活性和茶多酚含量變化的月節(jié)律，以及機(jī)械損傷誘導(dǎo)葉片和新梢PAL活性和茶多酚含量的時(shí)序變化。[結(jié)果]各品種未做任何損傷處理時(shí)，PAL酶活之間無明顯差異，機(jī)械損傷1 h后，不論是輕修剪還是重修剪，3個(gè)品種間的PAL酶活均差異極顯著；機(jī)械損傷對(duì)茶多酚含量的影響較PAL酶活有時(shí)間上的延遲；機(jī)械損傷對(duì)茶樹新梢的PAL酶活和茶多酚含量有一定的影響，并且對(duì)不同品種的影響不同。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討機(jī)械損傷對(duì)茶樹生長(zhǎng)和抗逆性的影響及其生理生化應(yīng)答機(jī)理提供了參考。

關(guān)鍵詞 茶樹；機(jī)械損傷；PAL酶；茶多酚

中圖分類號(hào) S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）05-011-04

Abstract[Objective]The aim was to determine effects of mechanical wounding on PAL activity and tea polyphenol of leaves and new branch of different tree plants.[Method]By using Shu Chazao， Fuzao 2 and Fuding Dabai tea as test materials， adopting spectrophotometer method， PAL activity and content of tea polyphenol of normal tea plant and mechanical wounding leaves and new branch were measured[Result]The result showed there was no significant difference in PAL activity between 3 varieties without any damage. In 1h after mechanical damage， difference is significant at the 0.01. Compared with PAL activity， the amount of polyphenol changed later. The PAL activity and the amount of polyphenol in new shoots was influenced by mechanical damage， and it was different in different varieties.[Conclusion]The experiment results provide reference for further discussing effects of mechanical wounding on tea plant growth and resistance， as well as physiological growth response mechanism.

Key words Tea plant； Mechanical wounding； Phenylananine ammonialyase； Tea polyphenol

植物遭受機(jī)械損傷后產(chǎn)生一系列次生代謝物質(zhì)如酚類、黃酮類、萜類、生物堿等，集中在傷口及其附近部位，參與傷愈合反應(yīng)和抵抗昆蟲或病菌的入侵[1]。這些次生代謝物質(zhì)主要通過苯丙烷類代謝途徑生成，苯丙氨酸解氨酶（Phenylananine ammonialyase，PAL，EC4.3.1.5）是催化這一途徑的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、防紫外輻射、抵御病蟲害和構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等方面具有重要的意義和價(jià)值，其活性可以作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)[2]。由于酚類物質(zhì)在植物抗生物脅迫機(jī)制中起著重要作用，PAL又被視為重要的防御酶，機(jī)械損傷也被認(rèn)為是誘導(dǎo)植物防御的重要手段之一[3]。

植物從感受傷刺激到PAL基因表達(dá)之間存在一系列的信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)換過程。已有研究表明，茉莉酸類化合物（JAs）是傷反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中必不可少的信號(hào)分子[4]。而PAL的表達(dá)調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，但國(guó)內(nèi)外對(duì)植物PAL的研究集中在它的提取純化、抗逆境、抗病蟲害、生理作用等方面，關(guān)于其基因表達(dá)和調(diào)控方面的研究較少，對(duì)PAL的表達(dá)調(diào)控機(jī)理尚不清楚。目前，已報(bào)道了多種植物PAL的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，但有關(guān)PAL轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道較少。目前公認(rèn)的是R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)苯丙烷代謝途徑中的合成酶，也可以對(duì)傷害進(jìn)行應(yīng)答[5-6]。

茶樹作為一種多年生常綠葉用經(jīng)濟(jì)作物，不斷遭受人為損傷（采摘及修剪），過度的機(jī)械損傷會(huì)加速茶樹的衰老，直接影響鮮葉的內(nèi)含成分、鮮葉的適制性和成茶品質(zhì)。鑒于此，筆者以不同茶樹無性系品種為試驗(yàn)材料，研究了機(jī)械損傷后茶樹葉片和茶樹新梢的PAL酶活及茶多酚含量的變化，以期為探討機(jī)械損傷對(duì)茶樹生長(zhǎng)和抗逆性的影響及其生理生化應(yīng)答機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)品種。福鼎大白茶、鳧早二號(hào)、舒茶早。

1.1.2 試劑與儀器。

沒食子酸（GA）標(biāo)樣購自安徽合肥博美公司；福林肖卡試劑購自美國(guó)Sigma公司；植物苯丙氨酸解氨酶試劑盒（Elisa）購自上海源葉生物科技有限公司。SUNRISE酶標(biāo)儀，Tecan公司；RT3100全自動(dòng)洗板機(jī)，雷杜公司；DHP9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；756紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所資源圃進(jìn)行。資源圃中均為同期栽種的成年茶樹。每個(gè)品種面積為10 m×20 m。2015年6月5日進(jìn)行機(jī)械損傷處理，其中處理①剪去新梢綠桿，簡(jiǎn)稱為輕修剪；處理②剪去新梢紅桿，簡(jiǎn)稱為重修剪；對(duì)照不做任何處理。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。在機(jī)械損傷后以損傷枝上第1片完整無損的成熟葉片為樣品材料，以1個(gè)月為周期，連續(xù)采摘8次，采摘間隔依次為機(jī)械損傷后1 h、4 h、8 h、24 h、72 h、7 d、15 d、30 d。機(jī)械損傷35～40 d取損傷枝上萌發(fā)的1芽2葉新梢為樣品材料。樣品采集后置于液氮中迅速冷凍，保存于-40 ℃冰箱中備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

茶多酚含量測(cè)定采用福林酚比色法，參照GB/T 8313-2008，結(jié)果以鮮重質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示。

苯丙氨酸解氨酶含量測(cè)定參照植物L(fēng)苯丙氨酸解氨酶ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書，結(jié)果以U/g記。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件中的方差分析方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。茶樹不同機(jī)械損傷處理間、不同品種間葉片與新梢PAL酶活與茶多酚含量的比較采用最小顯著差異t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械損傷對(duì)茶樹葉片中PAL活性的影響

2.1.1 不同處理對(duì)茶樹葉片PAL活性的影響。由圖1～3可知，不做任何處理時(shí)，在1個(gè)周期內(nèi)，3個(gè)品種葉片PAL酶活有較大幅度的波動(dòng)。機(jī)械損傷后，3個(gè)品種PAL酶活的變化趨勢(shì)與對(duì)照有明顯不同。舒茶早、鳧早2號(hào)、福鼎大白茶在輕修剪1 h后PAL酶活均高于對(duì)照；舒茶早和鳧早2號(hào)在重修剪1 h后PAL酶活高于對(duì)照，4 h后對(duì)照PAL酶活性增加，機(jī)械損傷后的PAL活性均有所下降；舒茶早與福鼎大白茶不同機(jī)械損傷處理后葉片PAL酶活有相似的變化趨勢(shì)，均先小幅增長(zhǎng)后下降，在7 d時(shí)PAL酶活達(dá)到一個(gè)最大值，到30 d時(shí)舒茶早對(duì)照的PAL酶活大幅度增長(zhǎng)，機(jī)械損傷后的PAL酶活卻下降，而福鼎大白茶在15 d后3種處理的PAL酶活已趨同；鳧早2號(hào)葉片PAL酶活對(duì)不同機(jī)械損傷處理的響應(yīng)不同，輕修剪的PAL酶活在1 h時(shí)迅速升高至最高點(diǎn)，而重修剪的PAL酶活在8 h時(shí)才達(dá)到峰值。

單因素方差表明，各品種未做任何損傷處理時(shí)，PAL酶活之間不存在明顯差異，機(jī)械損傷1 h后，不論是輕修剪還是重修剪，3個(gè)品種PAL酶活均差異顯著；重修剪72 h后，3個(gè)品種間PAL酶活差異顯著。

對(duì)不同品種機(jī)械損傷后PAL酶活隨時(shí)間變化的LSD分析結(jié)果表明，輕修剪1 h后，鳧早2號(hào)PAL酶活與舒茶早、福鼎大白茶間差異顯著；重修剪1 h后，鳧早2號(hào)PAL酶活與福鼎大白茶差異顯著，福鼎大白茶與舒茶早間差異顯著；重修剪72 h后，鳧早2號(hào)PAL酶活與福鼎大白茶差異顯著。

2.1.2 不同處理對(duì)茶樹新梢PAL活性的影響。由圖4可知，機(jī)械損傷處理后各品種的新梢PAL酶活均低于對(duì)照，3個(gè)品種中以鳧早2號(hào)的新梢PAL酶活性最高，福鼎大白茶的新梢PAL酶活性最低。

2.2 機(jī)械損傷對(duì)茶樹葉片茶多酚含量的影響

2.2.1 不同處理對(duì)茶樹葉片茶多酚含量的影響。

由圖5～7可知，機(jī)械損傷后，不論是輕修剪還是重修剪，在24 h內(nèi)，3個(gè)品種的茶多酚含量均低于對(duì)照；輕修剪處理后舒茶早的茶多酚含量上升，在72 h時(shí)高于對(duì)照，同時(shí)重修剪處理后福鼎大白茶的茶多酚含量也上升，高于對(duì)照；在7 d時(shí)，舒茶早的茶多酚含量下降至最低點(diǎn)，對(duì)照的茶多酚含量比輕修剪低，比重修剪高，之后茶多酚含量又迅速升高；鳧早2號(hào)機(jī)械損傷后，不論是輕修剪還是重修剪，茶多酚含量均低于對(duì)照，機(jī)械損傷處理后茶多酚含量的變化趨勢(shì)與對(duì)照相似；與舒茶早不同的是，在機(jī)械損傷后7 d，鳧早2號(hào)對(duì)照和重修剪的茶多酚含量升高到峰值，而輕修剪降低至最低點(diǎn)；福鼎大白茶對(duì)照與輕修剪的茶多酚含量最低點(diǎn)出現(xiàn)在機(jī)械損傷后72 h，重修剪的茶多酚含量最低點(diǎn)在機(jī)械損傷后8 h。

2.2.2 不同處理對(duì)茶樹新梢茶多酚含量的影響。由圖8可知，機(jī)械損傷對(duì)不同品種茶樹新梢茶多酚含量的影響不同，鳧早2號(hào)不論是輕修剪還是重修剪的新梢茶多酚含量均高于對(duì)照；福鼎大白茶不論是輕修剪還是重修剪的新梢茶多酚含量均低于對(duì)照；舒茶早輕修剪的新梢茶多酚含量高于對(duì)照，而重修剪的新梢茶多酚含量低于對(duì)照，各處理間差異顯著，其中重修剪新梢茶多酚含量與對(duì)照及輕修剪的新梢茶多酚含量差異顯著。

2.3 機(jī)械損傷后茶樹葉片PAL活性與茶多酚含量的相關(guān)性分析

2.3.1 不同處理間茶樹葉片PAL活性與茶多酚含量的相關(guān)性。

鳧早2號(hào)輕修剪后茶樹葉片的PAL活性與茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.517）；無論是對(duì)照還是機(jī)械損傷對(duì)茶多酚含量的影響相對(duì)PAL酶活都有時(shí)間上的延遲，對(duì)照8 h的PAL酶活與30 d時(shí)茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.777），15 d的PAL酶活與30 d時(shí)的茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.889）；輕修剪1 h的PAL酶活與8 h的茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.702），與15 d的茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.695）；輕修剪4 h的PAL酶活與7 d的茶多酚含量顯著正相關(guān)（r=0.979）；輕修剪72 h的PAL酶活與72 h的茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.726）；輕修剪30 d的PAL酶活與4 h的茶多酚含量顯著正相關(guān)（r=0.825）。重修剪1 h的PAL酶活與72 h的茶多酚顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.766）；重修剪4 h的PAL酶活與72 h的茶多酚顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.951）。

2.3.2 不同處理間茶樹葉片PAL活性、茶多酚含量與新梢PAL活性、茶多酚含量的相關(guān)性。

機(jī)械損傷對(duì)茶樹新梢的茶多酚含量有一定的影響，輕修剪新梢茶多酚含量與輕修剪8 h的PAL酶活顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.807），重修剪新梢茶多酚含量與重修剪72 h的PAL酶活顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.870），與15 d的PAL酶活顯著正相關(guān)（r=0.733），與24 h的茶多酚含量顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.782），與72 h的茶多酚含量極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.798）。

3 結(jié)論與討論

該研究從生理生化方面比較了茶樹不同機(jī)械損傷程度成熟葉片與新梢的茶多酚與PAL隨時(shí)間變化的差異，為探明茶樹機(jī)械損傷誘導(dǎo)防御系統(tǒng)反應(yīng)的機(jī)制提供了理論支撐；初步探討了機(jī)械損傷對(duì)茶樹新梢的生理生化影響，對(duì)進(jìn)一步研究機(jī)械損傷對(duì)茶葉質(zhì)量與品質(zhì)的影響有一定的指示作用；研究了不同品種的機(jī)械損傷誘導(dǎo)防御反應(yīng)在PAL酶活與酚類物質(zhì)上的積累差異，表明不同品種對(duì)機(jī)械損傷的防御反應(yīng)程度不同，存在種質(zhì)特異性，為種質(zhì)早期鑒定指明了研究方向。

該研究表明，茶樹葉片PAL酶活對(duì)機(jī)械損傷后的響應(yīng)是快速的，相比PAL酶活的急速變化，茶多酚含量的變化有所延遲，變化的程度也較平穩(wěn)，而且與PAL酶活有此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。機(jī)械損傷直接刺激植株，較其他方式更快啟動(dòng)苯丙烷類代謝途徑，促進(jìn)生成大量的PAL酶，大量的PAL酶促進(jìn)酚類的形成，酚類物質(zhì)的積累又反饋抑制PAL酶的合成。適量酚類的形成有助于植株的抗病蟲害能力[7-8]，而過量酚類物質(zhì)的積累對(duì)植株又是有害的，可加速植株的老化，并且對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不利，影響產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。

目前，機(jī)械損傷誘導(dǎo)茶樹防御反應(yīng)機(jī)制仍有一系列問題亟待解決。例如，茶樹受傷后，PAL活性誘導(dǎo)中的正負(fù)調(diào)控因子尚不明確；調(diào)控因子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合如何調(diào)控酚類物質(zhì)的生物合成。解決上述問題，有助于進(jìn)一步探明機(jī)械損傷誘導(dǎo)PAL酶活與酚類物質(zhì)積累的機(jī)制。

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