穆簫吟，劉莉

(1.貴州省醫(yī)藥(集團(tuán))有限責(zé)任公司 科技部，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴州省第三人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽(yáng) 550000)

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液中4種內(nèi)酯含量

穆簫吟1Δ，劉莉2

(1.貴州省醫(yī)藥(集團(tuán))有限責(zé)任公司 科技部，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴州省第三人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽(yáng) 550000)

目的 采用“一測(cè)多評(píng)”法同時(shí)測(cè)定舒血寧注射液中4種內(nèi)酯成分(白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C)的含量，并考察其方法學(xué)。方法 以白果內(nèi)酯為內(nèi)參物，建立舒血寧注射液中白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C間的相對(duì)校正因子；采用外標(biāo)法測(cè)定舒血寧注射液中白果內(nèi)酯的含量，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯A、B、C的含量，并將用“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定的5批舒血寧注射液含量的結(jié)果與用外標(biāo)法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果 在一定的線(xiàn)性范圍內(nèi)，白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C的相對(duì)校正因子分別為：2.280、1.659、1.429，且在不同的實(shí)驗(yàn)條件下重現(xiàn)性良好；5批舒血寧注射液的“一測(cè)多評(píng)”法計(jì)算值與外標(biāo)法測(cè)定值經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)所得的校正因子可信。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所建立的校正因子重復(fù)性良好，可用于舒血寧注射液中多個(gè)成分的定量分析與質(zhì)量評(píng)價(jià)。

一測(cè)多評(píng)；舒血寧注射液；相對(duì)校正因子；內(nèi)酯；內(nèi)參物；外標(biāo)法

舒血寧注射液是由銀杏葉提取物制備的滅菌水溶液，其有效成分主要為黃酮苷類(lèi)、萜類(lèi)內(nèi)酯活性物質(zhì)，包括槲皮素、山奈酚、異鼠李素、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯等?，F(xiàn)代研究表明其具有擴(kuò)張心腦血管，改善微循環(huán)、提高機(jī)體缺氧耐受力、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、拮抗血小板活化因子、降低血液黏度、抗血栓、抗氧化、抗病毒等藥理作用。臨床上被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、糖尿病并發(fā)癥等疾病的治療，具有較好的療效[1]。關(guān)于舒血寧注射液含量測(cè)定方面的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，但由于中藥對(duì)照品昂貴、不易得等原因限制了含量測(cè)定方法的推廣使用。本實(shí)驗(yàn)以舒血寧注射液中的白果內(nèi)酯為內(nèi)參物，建立白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C間的相對(duì)校正因子，實(shí)現(xiàn)用“一測(cè)多評(píng)”法同步測(cè)定舒血寧注射液中4種成分的含量。

一測(cè)多評(píng)法是指利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測(cè)定一個(gè)成分實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定[3]，該方法是通過(guò)建立成分之間的相對(duì)校正因子來(lái)對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定量檢測(cè)，因而校正因子在不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)條件下的重現(xiàn)性如何是“一測(cè)多評(píng)”法定量是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵?！耙粶y(cè)多評(píng)”法的另一個(gè)關(guān)鍵因素是成分色譜峰的定位方法，常用的色譜峰定位方法有“相對(duì)保留時(shí)間定位法”和“保留時(shí)間差定位法”。

本實(shí)驗(yàn)考察了所建立的相對(duì)校正因子在不同儀器及不同實(shí)驗(yàn)條件下的重現(xiàn)性，并采用“相對(duì)保留時(shí)間定位法”對(duì)各待測(cè)成分的色譜峰進(jìn)行了定位；最后，將用“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定的5批舒血寧注射液含量的結(jié)果與用HPLC外標(biāo)法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行了t檢驗(yàn)，對(duì)將“一測(cè)多評(píng)”法應(yīng)用于舒血寧注射液多組分的含量測(cè)定進(jìn)行了較為全面的考察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：舒血寧注射液(通化谷紅制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z22026296，規(guī)格：5 mL/支，批號(hào)：141107/1、150307/2、150511/1、150615/2、150809/2)；白果內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：110865 - 200303)、銀杏內(nèi)酯A、B、C對(duì)照品(批號(hào)：110862-200305、110863-200204、110864 - 200203)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。甲醇、四氫呋喃為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器：Aglient1100高效液相色譜系統(tǒng)(蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)，色譜柱分別為：Dikxna Cl8(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Luna C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。AB135S型電子天平(梅特勒-托利多)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制：①混合對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯對(duì)照品適量，加丙酮制成每1 mL分別含銀杏內(nèi)酯A、B、C 和白果內(nèi)酯0.1、0.05、0.1、0.25 mg的對(duì)照品混合溶液，即得。

② 供試品溶液：取舒血寧注射液10支(5 mL/支)，混勻，精取25 mL，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，然后用乙酸乙酯提取4次(80、40、40、40 mL)，合并乙酸乙酯液，用5%的醋酸鈉溶液80 mL洗滌，分離出乙酸乙酯層，醋酸鈉溶液再用乙酸乙酯40 mL洗滌，合并乙酸乙酯液及洗滌液，用水洗滌2次，每次80 mL，分離乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)颖m量溶解，并轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

1.2.2 色譜條件[2]：色譜柱：Dikxna Cl8(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：四氫呋喃-甲醇-水(10:20:75)；流速：1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；以空氣為載氣，流速3 L/min；漂移管溫度：105 ℃；柱溫：40 ℃。

在上述色譜條件下，取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，記錄色譜圖。

1.2.3 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察：

① 線(xiàn)性關(guān)系的考察：精密量取1.2.1項(xiàng)下銀杏內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，按1.2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X， μg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

② 校正因子的計(jì)算：以白果內(nèi)酯為內(nèi)參物，在2個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室間分別對(duì)銀杏內(nèi)酯A、B、C的校正因子進(jìn)行復(fù)核計(jì)算，公式如下[4]。

fk/m= fk/ fm=(Wk×Am)/ (Wm×Ak)

Ak:內(nèi)參物峰面積，Wk:內(nèi)參物濃度；Am:其他組分m峰面積，Wm:其他組分m濃度。

③ 精密度試驗(yàn)：分別精取1.2.1項(xiàng)下①的銀杏內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄各成分的色譜峰面積。

④ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一舒血寧注射液供試品溶液10 μL，室溫放置，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、 8、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩(wěn)定性。

⑤ 重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取同一舒血寧注射液供試品溶液6份，每份10 μL，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

⑥ 加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的舒血寧注射液樣品(141107/1)9份，3份為1組，分別加入約相當(dāng)于樣品含量50 %、100 %、150 %的銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯對(duì)照品，照1.2.1銀杏內(nèi)酯項(xiàng)下處理方法制備供試溶液，精密吸取該供試溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。

1.2.4 校正因子重現(xiàn)性的考察及各組分色譜峰的定位

① 不同儀器及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響：本實(shí)驗(yàn)考察了不同儀器和不同色譜柱對(duì)相對(duì)校對(duì)因子的影響，方法按上述色譜條件進(jìn)樣分析。

② 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響：實(shí)驗(yàn)在不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用島津LC20A高效液相色譜系統(tǒng)、Dikxna Cl8色譜柱分別考察了不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響。

③ 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響：實(shí)驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用島津LC20A高效液相色譜系統(tǒng)、Dikxna C18色譜柱分別考察了不同的流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響。

1.2.5 待測(cè)組分色譜峰的定位：由相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]可知，在色譜峰的定位方法選擇上，相對(duì)保留時(shí)間定位法優(yōu)于保留時(shí)間差定位法，相對(duì)保留時(shí)間定位法在一測(cè)多評(píng)中使用更為廣泛。本實(shí)驗(yàn)分別考察了采用不同的色譜儀及色譜柱時(shí)，銀杏內(nèi)酯A、B、C色譜峰與白果內(nèi)酯色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。

1.2.6 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較：實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法對(duì)5批舒血寧注射液的含量進(jìn)行了檢測(cè)，取舒血寧注射液5批(通化谷紅制藥有限公司，規(guī)格：5 mL/支，批號(hào)：141107/1、150307/2、150511/1、150615/2、150809/2)，照“1.2.1”項(xiàng)下方法處理，“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)法”計(jì)算舒血寧注射液中各組分的含量，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，證明2種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 回歸方程及線(xiàn)性范圍：各組分的色譜圖見(jiàn)圖1、圖2；回歸方程及線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

圖1 總內(nèi)酯混合對(duì)照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of total lactones mixed reference substances

圖2 供試品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample

2.1.2 校正因子的計(jì)算結(jié)果：2個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的差異較小(RSD<1.0%)，見(jiàn)表2。

表2 不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的相對(duì)校正因子(銀杏總內(nèi)酯)

2.1.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.3 %、0.2 %、0.5 %及0.6 %, 表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0. 9 %、0.7 %、1.2 %及1.5 %，表明舒血寧注射液供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0. 3 %、0.5 %、0.2 %及0.3 %，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn)：加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種銀杏總內(nèi)酯類(lèi)成分的加樣回收率結(jié)果(n=9)

2.2 校正因子重現(xiàn)性的考察及各組分色譜峰的定位

2.2.1 不同儀器及色譜柱對(duì)校正因子的影響：結(jié)果表明不同儀器和不同色譜柱所得的相對(duì)校正因子差異性較小(RSD<0.5 %)，見(jiàn)表4。

表4 不同儀器及色譜柱RCF耐用性考察(銀杏總內(nèi)酯)

2.2.2 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響：結(jié)果表明柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響不顯著(RSD<0.5 %)，見(jiàn)表5。

表5 不同柱溫RCF耐用性考察(銀杏總內(nèi)酯)

2.2.3 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響：結(jié)果表明不同的流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響RSD<0.5 %，見(jiàn)表6。

表6 不同流速RCF耐用性考察(銀杏總內(nèi)酯)

2.3 待測(cè)組分色譜峰的定位 結(jié)果表明，不同色譜儀及色譜柱所測(cè)得的各成分相對(duì)保留時(shí)間差異無(wú)顯著性意義(RSD<0.5 %)，見(jiàn)表7。

表7 不同色譜儀及色譜柱相對(duì)保留時(shí)間(銀杏總內(nèi)酯)

2.4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較：結(jié)果表明2種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表8。

表8 不同批次樣品的含量測(cè)定(n=5)

3 討論

3.1 一測(cè)多評(píng)法的色譜峰的定位 中藥的化學(xué)成分非常復(fù)雜，在不同的色譜系統(tǒng)中會(huì)有不同的色譜峰，在同一色譜系統(tǒng)中，其色譜峰的數(shù)量、出峰時(shí)間及峰形等也受到色譜柱、儀器、溶劑、柱溫等諸多因素的影響，因此，待測(cè)成分色譜峰的定位至關(guān)重要。對(duì)于在一定的色譜條件下，色譜峰相對(duì)較少的中藥，可根據(jù)《中藥注射劑色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》[7]推薦的相對(duì)保留時(shí)間對(duì)各組分的色譜峰進(jìn)行定位。本實(shí)驗(yàn)采取該方法定位，相對(duì)保留時(shí)間在不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱條件下重現(xiàn)性較好(RSD<0.5 %)。

3.2 “一測(cè)多評(píng)”法內(nèi)參物的選擇 實(shí)驗(yàn)選擇白果內(nèi)酯作為內(nèi)參物，因?yàn)樵摮煞衷谑嫜獙幾⑸湟褐泻枯^高，且性質(zhì)穩(wěn)定[8]。

3.3 檢測(cè)方法的選擇 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，銀杏萜類(lèi)內(nèi)酯含量測(cè)定方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、示差檢測(cè)法、ELSD法等。由于萜類(lèi)內(nèi)酯在紫外區(qū)吸收較弱，極少量的黃酮雜質(zhì)將會(huì)嚴(yán)重干擾檢測(cè)，使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)較為困難，而示差檢測(cè)器靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性相對(duì)較差。本文參考有相關(guān)文獻(xiàn)[2]，選擇蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)舒血寧注射液中的4種萜類(lèi)內(nèi)酯成分進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

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(編校：王冬梅)

《中國(guó)生化藥物雜志》參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)

綜述類(lèi)文章參考文獻(xiàn)一般不少于25條，其他論文一般不少于15條；采用順序編碼制著錄，依照其在文中出現(xiàn)的先后順序用阿拉伯?dāng)?shù)字加方括號(hào)標(biāo)出；參考文獻(xiàn)請(qǐng)作者盡量選擇近3年發(fā)表的文獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)需引用本刊1～2篇文獻(xiàn)；參考文獻(xiàn)的作者，1～3名全部列出，3名以上者只列前3名，后加“等”或“et al”。英文文獻(xiàn)中的作者姓名寫(xiě)法為：完整姓氏在前，名字采用縮寫(xiě)字母在后。外文期刊縮寫(xiě)以美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館編輯的《Index Medicus》格式為準(zhǔn)；中文期刊用全名。

舉例：

期刊：[序號(hào)]作者.文題[J].刊名，年，卷(期)：起頁(yè)-止頁(yè).

書(shū)籍：[序號(hào)]作者.書(shū)名[M].版次.出版地：出版者，出版年：起頁(yè)-止頁(yè).

Simultaneous determination of four lactones ingredients content in Shuxuening injection by quantitative analysis of multi-components by single marker

MU Xiao-yin1Δ, LIU Li2

(1.Department of Science and Technology, Guizhou Pharmaceutical (Group) Limited Liability Company, Guiyang 550000, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Guizhou, Giyang 550000, China)

ObjectiveTo simultaneous determine four lactones(bilobalide and ginkgolides A, B and C) ingredients content in Shuxuening injection by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS),and evaluation the methodological.MethodsWith Ginkgo esters as the indexes,the relative correction factor(RCFs) between bilobalide and ginkgolides A, B, C were established. The content of bilobalide in Shuxuening injection were determined by external standard method, the content of ginkgolides A, B, C in Shuxuening injection was calculated by the relative correction factor. The results of the content of 5 batches of Shuxuening injection determined by QAMS and tested by external standard method were carried out by t test. ResultsThe RCFs of ginkgolides A, B, C with reference to bilobalide were 2.280,1.659 and 1.429.And the repeatability was good under different experimental conditions. There was no significant differences between the calculated value and estimated value on QAMS and external standard method of the 5 batches of Shuxuening injection, the results showed that the RCF was authentic.ConclusionThe established correction factor is good repeatability,and could be used for quantitative analysis and quality evaluation of multiple components in Shuxuening injection.

multi-components by single marker(QAMS); Shuxuening injection; relative correction factor(RCFs); total lactones; indexes; external standard method

穆簫吟，通信作者，女，本科，主管藥師，研究方向：藥物質(zhì)量分析，E-mail：2484014252@qq.com。

R284.1

A

1005-1678(2016)01-0169-05