褚麗萍，劉金劍，楊翠紅，黃帆，劉鑒峰，張玉民

(北京協(xié)和醫(yī)學院&中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192)

阿霉素前藥納米粒/姜黃素聯(lián)合遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及其抗腫瘤研究

褚麗萍，劉金劍，楊翠紅，黃帆，劉鑒峰，張玉民Δ

(北京協(xié)和醫(yī)學院&中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192)

目的 以酸敏感阿霉素前藥納米粒為基礎，通過負載姜黃素構(gòu)建聯(lián)合遞送系統(tǒng)，從而在提高抗腫瘤細胞增殖效果的同時降低由阿霉素引起的心肌細胞毒性。方法 利用阿霉素(doxorubicin，DOX)的氨基與醛基化聚乙二醇(PEG-CHO)的醛基進行席夫堿反應得到PEG-DOX前藥聚合物，通過疏水作用將疏水性抗腫瘤藥物姜黃素(curcumin，Cur)負載到PEG-DOX的疏水內(nèi)核中，最后通過納米沉淀技術得到同時負載兩種藥物的前藥納米粒PEG-DOX/Cur NPs。通過核磁(1H-NMR)對PEG-DOX前藥進行結(jié)構(gòu)表征，利用動態(tài)光散射(DLS)和透射電鏡(TEM)對PEG-DOX/Cur NPs的粒徑和形貌進行表征；利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)研究PEG-DOX/Cur NPs在酸性條件下的藥物釋放行為；利用MTT法研究 PEG-DOX/Cur NPs的腫瘤細胞(H1975)增殖抑制效果以及評價PEG-DOX/Cur NPs對心肌細胞(H2C9)的毒性；通過H2C9細胞內(nèi)的氧化自由基(ROS)水平檢測(2′,7′-二氯熒光素二乙酸鹽法，DCFH-DA法)揭示PEG-DOX/Cur NPs對DOX心肌細胞毒性改善的機理。結(jié)果 PEG-DOX/Cur NPs為直徑約90 nm的均一的球形結(jié)構(gòu)，在酸性條件下能夠同步釋放DOX和Cur；MTT結(jié)果表明PEG-DOX/Cur NPs的H1975細胞增殖抑制效果優(yōu)于DOX和PEG-DOX NPs(P<0.05)，且PEG-DOX/Cur NPs對H2C9細胞的毒性明顯低于DOX和PEG-DOX NPs(P<0.05)；H2C9細胞ROS含量檢測結(jié)果表明PEG-DOX/Cur NPs處理的心肌細胞具有最低的ROS水平(P<0.05)，由此說明PEG-DOX/Cur NPs較低的心肌細胞毒性可能源于Cur引起的胞內(nèi)ROS的降低所致。結(jié)論 基于DOX前藥納米粒負載Cur構(gòu)建聯(lián)合遞送系統(tǒng)在實現(xiàn)了理想的腫瘤細胞增殖抑制效果的同時，明顯的降低了由DOX引起的心肌細胞毒性，實現(xiàn)了聯(lián)合治療的效益最大化。

納米粒前藥；阿霉素；姜黃素；聯(lián)合治療；心肌毒性

據(jù)世界衛(wèi)生組織組織統(tǒng)計，全世界每年約有400多萬人死于癌癥，癌癥已躍居死亡率的首位[1]。如何抗癌已成為現(xiàn)代醫(yī)學科技的重大挑戰(zhàn)之一。在各種腫瘤治療中，由于小分子化療藥物對殺死腫瘤的高效性，成為了必不可少的選擇。然而，由于其本身的物理化學特性導致的生物利用度差、血液/腎清除速率高、特異性差、腫瘤蓄積濃度低、毒副作用大，以及易產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥等問題嚴重限制了其臨床應用[2]。納米藥物遞送系統(tǒng)的提出明顯的改善了化療制劑的水溶性、生物利用度、藥代動力學特性，一定程度上提高了抗腫瘤效率及降低了對機體的毒副作用[3-6]。傳統(tǒng)的納米載體藥物僅僅負載一種藥物，由于其緩慢的釋放藥物并不能夠從根本上改善抗腫瘤效果，以及徹底解決對機體的毒性反應[7-9]。因此，本實驗設計了一個能夠同時遞送兩種化療藥物的前藥納米粒，即疏水抗腫瘤藥物1直接作為疏水內(nèi)核，與合適尺寸的親水段聚乙二醇(PEG)通過化學鍵合起來，二者通過親疏水作用組裝成具有一定形態(tài)的功能性前藥納米載體；前藥納米載體中的疏水內(nèi)核(疏水性抗腫瘤藥物1)通過與疏水性抗腫瘤藥物2的疏水作用，將藥物2包覆在前藥納米載體中，實現(xiàn)了對兩種藥物的同時遞送。與聯(lián)合單體藥物治療比較，能夠徹底的降低系統(tǒng)毒性或其他副作用。此多藥物遞送系統(tǒng)保證有充足的藥物能夠到達腫瘤部位，確保聯(lián)合治療的協(xié)同效應以及改善抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:端基醛基功能化的聚乙二醇(mPEG2000-CHO)購自于北京鍵凱科技有限公司；姜黃素(curcumin)和鹽酸鹽阿霉素(DOX-HCL)購自浙江海正藥業(yè)有限公司；2′,7′-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA)購自于美國sigma-aldrich公司；其它生化試劑均購自于希恩思生化科技有限公司。小鼠肺癌細胞(H1975細胞)和小鼠心肌細胞(H2C9細胞)由南開大學楊志謀教授惠贈。

1.1.2 主要儀器:動態(tài)光散射粒度儀(DLS，Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments，美國)；透射電鏡(TEM；Tecani G2 F20系統(tǒng)，美國)；1H核磁共振波譜儀(VARIAN Unity Plus 400 MHz，Varian Instruments，美國)；反相高效液相色譜儀(RP-HPLC，Waters，美國)；全波長酶標儀(VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美國)。

1.2 方法

1.2.1 PEG-DOX的合成及表征：通過DOX的氨基與mPEG2000-CHO的醛基反應形成席夫堿鍵，得到DOX前藥聚乙二醇-阿霉素(PEG-DOX)。稱取300 mg mPEG2000-CHO和80 mg DOX-HCL，共溶解于3.0 mL無水二甲基亞砜(DMSO)中，加入30 μL三乙胺(Et3N)催化該反應，40 ℃油浴條件下反應24 h，得到具有酸敏感的PEG-DOX。隨后利用透析方法逐次地將未反應的DOX-HCL和DMSO透析出來，得到PEG-DOX水溶液，通過真空凍干48 h得到PEG-DOX凍干粉。通過1H核磁共振波譜儀對PEG-DOX進行化學結(jié)構(gòu)表征。

1.2.2 PEG-DOX/Cur NPs和PEG-DOX NPs的制備及表征：稱取10 mg PEG-DOX凍干粉和2 mg Cur充分溶解溶于2.0 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)內(nèi)，通過納米沉淀技術緩慢地滴于8.0 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，震蕩12 h后利用透析的方法除去有機溶劑DMF。得到基于DOX前藥納米粒的聯(lián)合遞送系統(tǒng)PEG-DOX/Cur NPs。PEG-DOX NPs的制備方法同上。通過DLS測定PEG-DOX NPs和PEG-DOX/Cur NPs的粒徑，利用TEM對其納米形貌進行表征。

1.2.3 體外藥物釋放：取2份2.0 mL PEG-DOX/Cur NPs溶液裝入分子截留量為3500的透析袋內(nèi)，分別置于裝有50 mL PBS(pH 7.4和pH 5.0)的燒杯內(nèi)，37 ℃恒溫震蕩，在不同孵育時間取5.0 mL透析液，通過RP-HPLC檢測不同時間DOX和Cur的釋放量并繪制釋放曲線。

1.2.4 體外抗腫瘤試驗用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 RMPI1640培養(yǎng)小鼠肺癌細胞系H1975細胞，置于37 ℃、 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞以每孔5×103個接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，向各孔中分別加入一系列濃度梯度(按照DOX濃度為0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5和25 μg/mL和Cur濃度為0.08、0.16、0.312、0.625、1.25、2.5、5和10 μg/mL)的DOX-HCL、Cur、PEG-DOX NPs和PEG-DOX/Cur NPs，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后向孔內(nèi)加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后向孔內(nèi)加入150 μL DMSO溶液，充分震蕩后利用酶標儀檢測570 nm下各孔的吸光值。每個濃度設置6個復孔，根據(jù)公式細胞生存率=實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。計算每個濃度下的細胞生存率并繪制生存率曲線。

1.2.5 心肌細胞毒性:心肌細胞毒性試驗采用小鼠心肌細胞系H2C9細胞，細胞培養(yǎng)方法和MTT試驗步驟同1.2.4。每個濃度設置6個復孔。

1.2.6 心肌細胞ROS水平檢測:采用2′,7′-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA)作為探針檢測經(jīng)不同藥物處理后的心肌細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的水平。該方法的原理為：DCFH-DA分子本身沒有熒光，能夠自由的穿過細胞膜進入細胞，然后被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能夠穿透細胞膜，所以探針被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的ROS可以將DCFH氧化成具有熒光信號的DCF，細胞內(nèi)ROS的含量與DCF的熒光強度成正比。按照1.2.4中所述方法培養(yǎng)H2C9細胞，取對數(shù)生長期細胞接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜后分別將DOX-HCL、Cur、PEG-DOX NPs和PEG-DOX/Cur NPs(按照DOX濃度為20 μg/mL，Cur濃度為8 μg/mL)加入到孔內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后向每孔加入20 mM DCFH-DA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用PBS清洗細胞2-3次后利用酶標儀檢測細胞內(nèi)DCF的熒光強度，每個濃度設置6個復孔。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485 nm和525 nm。標準化熒光強度的計算公式為：實驗組熒光強度值/對照組熒光強度值×100。

2 結(jié)果

2.1 PEG-DOX的合成及結(jié)構(gòu)表征 在Et3N催化作用下合成PEG-DOX單體，通過圖1的核磁數(shù)據(jù)比較分析，反應后mPEG2000-CHO的醛基(CHO)峰消失和DOX-HCL的氨基(NH2)，證明席夫堿鍵(C=N)成功通過CHO與NH2合成，得到PEG-DOX單體。

圖1 DOX-HCL(A)，mPEG2000-CHO(B)和PEG-DOX單體(C)的核磁圖譜分析Fig.1 1H NMR spectra of DOX-HCL (A), mPEG2000- CHO (B) and PEG-DOX (C)

2.2 PEG-DOX/Cur NPs和PEG-DOX NPs的粒徑及形貌表征 通過納米沉淀技術和透析得到PEG-DOX NPs和PEG-DOX/Cur NPs。表征結(jié)果見圖2，通過DLS和TEM表征得到二者均為形貌均一的球形結(jié)構(gòu)，粒徑分別為64.2和88.4 nm。

圖2 PEG-DOX NPs(A)和PEG-DOX/Cur NPs(B)的DLS和TEM表征結(jié)果Fig.2 Hydrodynamic size distributions and TEM images of PEG-DOX NPs (A) and PEG-DOX/Cur NPs (B)

2.3 藥物釋放曲線 通過透析方法結(jié)合RP-HPLC檢測PEG-DOX/Cur NPs在不同條件下的DOX和Cur的釋放速率。結(jié)果見圖3，表明DOX和Cur在正常生理條件下均穩(wěn)定的裝載到前藥納米粒內(nèi)，釋放率低于10%；在模擬腫瘤環(huán)境的酸性條件下(pH 5.0), DOX和Cur均表現(xiàn)出較靈敏、快速的同步釋放，在24 h時釋放率高達70～80%。

圖3 PEG-DOX/Cur NPs中DOX和Cur在不同條件下的釋放曲線Fig.3 DOX and Cur release profiles of PEG-DOX-Cur NPs under different pH values.

2.4 體外抗腫瘤試驗 各個受試藥物對H1975細胞的增殖抑制能力結(jié)果見圖4。相對于DOX-HCL，PEG-DOX的腫瘤細胞增殖抑制能力稍差，但差異無統(tǒng)計學意義；而Cur 負載后的PEG-DOX/Cur NPs因可以同時遞送DOX和Cur實現(xiàn)了對腫瘤細胞的聯(lián)合殺傷，顯著增強了PEG-DOX對H1975細胞的增殖抑制能力。在DOX濃度為1.56 μg/mL和Cur濃度為0.625 μg/mL時，F(xiàn)值為15.057，細胞生存率PEG-DOX/Cur NPs(56.1±10.2%) vs. PEG-DOX NPs (79.0±4.2%)的P值為0.01。

圖4 不同藥物對H1975細胞的生存率影響的比較(n=6)Fig.4 Cytotoxicity of free DOX, Cur, PEG-DOX NPs and PEG-DOX/Cur NPs against H1975 cells (n=6)

2.5 心肌細胞毒性 據(jù)文獻報道[10-11]DOX在代謝過程中可誘導活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生。而ROS可通過線粒體依賴性的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導引起心肌細胞凋亡。對正常心肌細胞H2C9的毒性結(jié)果見圖5，與DOX-HCL和 PEG-DOX相比，PEG-DOX/Cur NPs同時遞送DOX和Cur，但其對H2C9細胞的毒性明顯降低(P<0.05)。在DOX濃度為1.56 μg/mL和Cur濃度為0.625 μg/mL時，F(xiàn)值為61.688， H2C9細胞的生存率PEG-DOX/Cur NPs(92.0±3.6%)相對于DOX(61.8±7.9%)和PEG-DOX NPs(56.5±5.6%)的P值分別為0.01和0.01。

圖5 不同藥物對心肌細胞的生存率影響的比較(n=6)Fig.5 Cytotoxicity of free DOX, Cur, PEG-DOX NPs and PEG- DOX/Cur NPs against H2C9 myocardial cells(n=6)

2.6 心肌細胞ROS水平檢測 因Cur具有清除ROS的能力，為了進一步確證DOX的心肌毒性是否是由其在心肌細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS所介導以及研究PEG-DOX/Cur NPs降低DOX心肌細胞毒性的機理，本研究進行了不同藥物處理的心肌細胞內(nèi)ROS水平檢測。如圖6所示，經(jīng)DOX-HCL 和PEG-DOX處理的心肌細胞顯示出了較高的ROS水平；而經(jīng)PEG-DOX/Cur NPs處理的心肌細胞ROS水平明顯降低，F(xiàn)值21.577，PEG-DOX/Cur NPs (67.0±3.3%)相對于DOX (162.4±25.9%)和PEG-DOX NPs(109.4±16.4%)的P值分別為0.01和0.027。由此說明在PEG-DOX/Cur NPs遞送系統(tǒng)中，DOX產(chǎn)生的ROS可能被Cur徹底清除，從而DOX的心肌細胞毒性得到了明顯的改善。

圖6 不同藥物處理后H2C9細胞內(nèi)ROS的含量的比較(n=6)Fig.6 The differences of ROS in the H2C9 cells treated by free DOX, Cur, PEG-DOX NPs and PEG-DOX/Cur NPs(n=6)

3 討論

基于嵌段共聚物作為納米遞送系統(tǒng)實現(xiàn)了對多個藥物的聯(lián)合遞送，然而由于其復雜的遞送體系降低了藥物的釋放效率，導致其聯(lián)合治療或協(xié)同治療的效果并不明顯[12]。本文中利用抗腫瘤藥物DOX直接作為疏水內(nèi)核組裝的前藥載體，通過疏水作用負載Cur制備PEG-DOX/Cur NPs，在到達酸性條件的腫瘤時，PEG-DOX/Cur NPs能夠通過響應性解體，實現(xiàn)同步遞送和高效釋放DOX和Cur，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的聯(lián)合治療。

體外抗腫瘤結(jié)果表明，單獨的PEG-DOX NPs 顯示了比 DOX-HCL 較溫和的細胞毒性，這是由于納米結(jié)構(gòu)與小分子藥物被腫瘤細胞攝取的機制不同所導致的[13]。即納米粒子首先通過細胞內(nèi)吞進入細胞，在細胞內(nèi)開始殺傷作用還需通過一個釋放過程。而小分子藥物直接通過被動擴散進入細胞，然后直接發(fā)揮抗腫瘤作用。而通過Cur負載到PEG-DOX NPs 構(gòu)建聯(lián)合遞送系統(tǒng)PEG-DOX/Cur NPs 之后，由于DOX 和Cur的不同抗腫瘤機制[10,11,14]，二者在細胞內(nèi)實現(xiàn)共同釋放后實現(xiàn)了對腫瘤細胞的聯(lián)合殺傷，即顯示了比單獨藥物 (DOX-HCL 或Cur) 更強的細胞毒性。

由于文獻報道DOX在代謝過程中可誘導活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生。而ROS可通過線粒體依賴性的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導引起心肌細胞凋亡[10,11]。本文中DOX-HCL對正常H2C9心肌細胞造成了較強的細胞毒性。PEG-DOX NPs由于上段所述的不同于DOX-HCL的進入細胞的機制，其顯示了相對較弱的細胞毒性。姜黃素作為天然的抗氧化藥物能夠很好清除體內(nèi)的ROS[15]。通過共負載DOX 和Cur在取得理想的抗腫瘤效果的同時，Cur通過其天然的抗氧化活性降低由DOX化療誘導產(chǎn)生的ROS水平，提高心肌細胞的生存率[16]。心肌細胞內(nèi)ROS含量的檢測進一步驗證了PEG-DOX/Cur NPs能夠降低心肌細胞內(nèi)ROS的水平，進而降低對心肌細胞的毒性作用。

本課題制備的前藥納米粒系統(tǒng)PEG-DOX/Cur NPs在細胞水平上的研究結(jié)果表明，通過聯(lián)合治療實現(xiàn)了較理想的抗腫瘤效果的同時，也明顯的降低了由DOX引起的心肌毒性，實現(xiàn)了聯(lián)合治療的效益最大化。

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(編校：譚玲)

Construction of a co-delivery system based on doxorubicin prodrug nanoparticle and curcumin and its application in anti-tumor study

CHU Li-ping, LIU Jin-jian, YANG Cui-hong, Huang Fan, LIU Jian-feng and ZHANG Yu-minΔ

(Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China)

ObjectiveTo construct a joint delivery system by loading curcumin, acid sensitive adriamycin nanoparticles as the basis, as to improve the anti-tumor cell proliferation activity and simultaneously decrease the cardiotoxicity induced by doxorubicin.MethodsThe PEG-DOX conjugate was synthesized by schiff base reaction between the amino of doxorubicin and the aldehyde group of aldehyde functionalized polyethylene glycol, the hydrophobic curcumin was loaded by PEG-DOX conjugate through the hydrophobic interaction between curcumin and the core of PEG-DOX conjugate, and then the prodrug nanoparticle PEG-DOX/Cur NPs was obtained by nanoprecipitation technique. The structure of PEG-DOX conjugate was confirmed by1H NMR. The diameter and morphology of PEG-DOX/Cur NPs were detected by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscope (TEM), and the DOX and Cur release kinetics under physiological and acidic condition were detected by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method. The in vitro combined antitumor effects and the cardiotoxicity of PEG-DOX/Cur NPs were evaluated by MTT method. The reactive oxygen species (ROS) within the myocardial cells was estimated by 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) method.ResultsThe PEG-DOX/Cur NPs showed spherical structure with diameter of about 100 nm with a narrow PDI. The PEG-DOX/Cur NPs could release DOX and Cur, simultaneously. The MTT results showed that PEG-DOX/Cur NPs had the best cytotoxicity on H197 cells and the lowest cardiotoxicity on H2C9 cells. Compared with DOX and PEG-DOX/Cur NPs, H2C9 cells administrated by PEG-DOX/Cur NPs showed the lowest ROS level, which indicated that the lowest cardiac myocyte toxicity of PEG-DOX/Cur NPs may result from the ROS clearance function of curcumin.ConclusionThe co-delivery system of PEG-DOX/Cur NPs based on PEG-DOX conjugate and curcumin achieved the maximum of effectiveness, with desirable anti-tumor proliferation effect and significantly improved cardiac myocyte toxicity induced by DOX.

prodrug nanoparticle; doxorubicin; curcumin; combination therapy; cardiotoxicity

國家自然科學基金(81471727)；“協(xié)和青年基金資助”和“中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助”(3332015100)；北京協(xié)和醫(yī)學院2015年度“協(xié)和新星”項目(1579)；中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所發(fā)展基金(1609)

褚麗萍，女，學士，副研究員，研究方向：細胞生物學，E-mail：chulp89@163.com；張玉民，男，通信作者，碩士，助理研究員，研究方向：功能納米藥物的構(gòu)建及其應用，E-mail：zhangyumin21@sina.cn。

R914.5

A

1005-1678(2016)01-0012-05