韋小越，周展，陳樞青

(浙江大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310058)

腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的手段
——個性化抗體偶聯(lián)藥物

韋小越，周展，陳樞青Δ

(浙江大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310058)

體細(xì)胞突變是腫瘤形成的重要原因和造成腫瘤異質(zhì)性的關(guān)鍵因素，傳統(tǒng)方法并未充分利用這一點(diǎn)對惡性腫瘤進(jìn)行針對性治療。精準(zhǔn)醫(yī)療(precision medicine)是建立在深入了解個體基因組信息和體細(xì)胞突變信息的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)進(jìn)行精確診斷，并借助靶向藥物等進(jìn)行精準(zhǔn)治療，為一種全新的個性化醫(yī)療模式，在惡性腫瘤的治療中日益凸顯出其臨床價值。癌細(xì)胞因基因突變產(chǎn)生特異性抗原，是抗體類靶向藥物的理想靶點(diǎn)。個性化抗體偶聯(lián)藥物(personalized antibody-drug conjugates，PADC)是將細(xì)胞毒性小分子偶聯(lián)到突變特異性抗體上的一類藥物，與傳統(tǒng)抗體偶聯(lián)藥物(ADC)不同，其僅特異性識別患者癌細(xì)胞上的突變新抗原，與正常細(xì)胞無交叉結(jié)合。因此PADC能將小分子毒物特異靶向到癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)增效減毒的效果，有望成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的重要手段。本文從體細(xì)胞突變產(chǎn)生腫瘤特異性抗原、發(fā)現(xiàn)新生抗原到特異性抗體制備、PADC的制備及定點(diǎn)清除腫瘤細(xì)胞幾方面進(jìn)行闡述，描繪出PADC作為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療手段的藍(lán)圖。

體細(xì)胞突變；精準(zhǔn)醫(yī)療；腫瘤突變特異性抗原；個性化；抗體偶聯(lián)藥物

精準(zhǔn)醫(yī)療是基于基因組信息和疾病體細(xì)胞突變信息，分析、鑒定特定患者特定疾病的生物標(biāo)志物，精確尋找疾病的治療靶點(diǎn)，并借助靶向藥物等手段為患者制定精準(zhǔn)的治療方案[1]?！熬珳?zhǔn)醫(yī)療(precision medicine)”計劃于2015年1月由奧巴馬正式提出，隨后6月在第51屆美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會新聞發(fā)布會上宣布了TAPUR和NCI-MATCH兩項(xiàng)致力于擴(kuò)展精準(zhǔn)醫(yī)療范疇的臨床研究計劃，其短期目標(biāo)便是治療腫瘤。體細(xì)胞突變造成腫瘤發(fā)生并使之具有正常細(xì)胞所沒有的特異性靶點(diǎn)，是精準(zhǔn)醫(yī)療的首選靶標(biāo)；“精確”是精準(zhǔn)醫(yī)療不同以往的特色，非常適合具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤治療(不同時期腫瘤治療方式見表1)。腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的一種有效手段是開發(fā)極具靶向性的抗體藥物，即制備針對腫瘤突變特異性抗原(tumor-specific mutant antigen，TSMA)的抗體，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性靶向。個性化抗體偶聯(lián)藥物(personalized antibody-drug conjugates，PADC)是將細(xì)胞毒性小分子偶聯(lián)到腫瘤突變特異性抗體上，使其兼具特異性靶向和強(qiáng)細(xì)胞殺傷力的特點(diǎn)，為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的有效治療方案[2]。

表1 不同時期腫瘤治療方法比較

ADC：抗體偶聯(lián)藥物，antibody-drug conjugates；TSMA：腫瘤突變特異性抗原，tumor-specific mutant antigens；PADC：個性化抗體偶聯(lián)藥物，personalized antibody-drug conjugates

PADC方案作為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療手段，涉及基因測序大數(shù)據(jù)分析處理、尋找癌細(xì)胞特異性新生抗原以及制備特異性抗體和PADC 3方面。具體步驟如下：①基因檢測及數(shù)據(jù)分析：通過高通量基因測序技術(shù)獲取患者癌細(xì)胞的基因信息，利用生物信息技術(shù)比對分析，提取重要的體細(xì)胞突變，預(yù)測篩選出能展現(xiàn)在癌細(xì)胞表面的TSMA并初步驗(yàn)證抗原；②制備特異性抗體：制備TSMA，利用噬菌體展示技術(shù)或雜交瘤技術(shù)制備腫瘤突變特異性抗體，對抗體特異性、親和力、穩(wěn)定性和活性等進(jìn)行評價；③制備PADC：將制備好的抗體與細(xì)胞毒性小分子毒物偶聯(lián)，完成PADC成藥性評價后用于患者腫瘤治療。見圖1。

1 腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的重要條件——體細(xì)胞突變

正常成人體內(nèi)的細(xì)胞分裂增殖、生長和凋亡受到嚴(yán)格控制，細(xì)胞數(shù)量維持在一定水平以保證機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)；腫瘤的形成是體細(xì)胞突變的結(jié)果。細(xì)胞有絲分裂過程中如DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，或細(xì)胞受到外界刺激(如化學(xué)、物理、生物刺激)時容易發(fā)生DNA突變(包括堿基替換、插入、缺失、重排等)。一部分突變能被細(xì)胞自我識別和修復(fù)，一部分突變細(xì)胞經(jīng)過組織里微環(huán)境的達(dá)爾文進(jìn)化篩選，發(fā)生不利突變的細(xì)胞會被殺死，而突變后具備生長優(yōu)勢的細(xì)胞得以存活下來。DNA突變隨著細(xì)胞的分裂增殖不斷積累，但并非所有的突變都會導(dǎo)致細(xì)胞癌變。驅(qū)動突變(driver mutation)和伴隨突變(passenger mutation)可以區(qū)分對細(xì)胞影響不同的突變：前者賦予細(xì)胞生長優(yōu)勢或者耐藥性，并且隨著癌細(xì)胞的分裂增殖而相對集中，一般分布在與細(xì)胞生長密切相關(guān)的蛋白中；后者對細(xì)胞生長并無太大影響，隨機(jī)分布在基因組里。一般認(rèn)為能改變細(xì)胞功能的突變需要積累5～7次的突變才能使正常細(xì)胞發(fā)生癌變[3]，所以一個癌細(xì)胞里可以存在多個驅(qū)動突變。

體細(xì)胞突變賦予了癌細(xì)胞有別于正常細(xì)胞的特性，這是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的首選靶標(biāo)[4]。新一代高通量測序技術(shù)為體細(xì)胞突變的發(fā)現(xiàn)提供了必要的信息，通過采集患者腫瘤組織，并以外周血正常細(xì)胞為對照，利用高通量全外顯子測序(whole-exome sequencing，WES)、全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)或表達(dá)譜分析技術(shù)(mRNA-Seq)等可以獲得腫瘤患者癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的基因序列及基因表達(dá)信息，再利用生物信息學(xué)技術(shù)從測序產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)中抽絲剝繭，鑒定出體細(xì)胞突變并進(jìn)一步篩選突變新生的TSMA[5-6]。目前研究者們已經(jīng)開發(fā)出許多序列數(shù)據(jù)處理工具，對突變進(jìn)行初步篩選，如分析單核苷酸突變(single nucleotide variants，SNV)及堿基插入的有GATK、VarScan、SomaticSniper、MuTect、Strelka、JointSNVMix等；分析突變蛋白功能及通路和網(wǎng)絡(luò)的有ANNOVAR、PolyPhen2、SIFT、HotNet、MuSiC、PathScan等[7-8]。近年來Ensembl、GENCODE、RefSeq、TransFac和Interpro等基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫相繼建成，為測序數(shù)據(jù)分析處理提供了非常重要的幫助[7]。利用多種分析工具，挑選出患者腫瘤特異性的突變，確定突變蛋白質(zhì)的功能及其在細(xì)胞的定位，為體細(xì)胞突變新抗原的候選提供依據(jù)。

分析得到的突變結(jié)果按細(xì)胞分布可分為膜蛋白胞外區(qū)突變，膜蛋白胞內(nèi)區(qū)突變和胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)蛋白突變。無論哪種突變，其產(chǎn)物都應(yīng)屬于腫瘤特異性蛋白，這有別于傳統(tǒng)基于高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)，是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的潛在靶點(diǎn)。但這些突變成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療靶標(biāo)的條件各不相同(見圖2)。胞膜外蛋白突變隨著蛋白表達(dá)而展現(xiàn)于細(xì)胞膜外側(cè)，突變后與野生型蛋白結(jié)構(gòu)上的差異即可使之成為TSMA。膜蛋白胞內(nèi)區(qū)突變和胞質(zhì)內(nèi)蛋白突變基本一致，依賴人體自身免疫系統(tǒng)，突變后蛋白依靠主要組織相容性復(fù)合體 (majorhistocompatibility complex，MHC)分子遞呈，展示到細(xì)胞外側(cè)才能成為TSMA。大多數(shù)腫瘤抗原是由MHCI分子遞呈的，也有部分抗原被MHCII分子遞呈[9]。蛋白在胞漿中被蛋白酶體水解成8～11個氨基酸大小的多肽片段，通過抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter associated with antigen processing，TAP)帶進(jìn)內(nèi)皮網(wǎng)狀組織中與MHCI分子的α鏈及β2微球蛋白組裝成多肽-MHC復(fù)合物，再進(jìn)入高爾基體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外側(cè)。遞呈出來的抗原分2種：一是正常細(xì)胞里野生型蛋白的多肽片段本身會被MHC分子遞呈，腫瘤細(xì)胞突變后多肽也會被遞呈，2者根據(jù)突變點(diǎn)氨基酸的不同而產(chǎn)生TSMA；二是正常細(xì)胞里野生型蛋白不被遞呈，突變后因結(jié)構(gòu)變化，水解多肽能與MHC分子結(jié)合而遞呈到腫瘤細(xì)胞表面，因此獲得特異性抗原[10]。

圖2 不同類型突變產(chǎn)生TSMAFig.2 Different kinds of mutations produce TSMA

每個患者外顯子測序結(jié)果顯示存在成百上千的體細(xì)胞突變點(diǎn)，但是最終能成為TSMA的卻非常少[11]，主要原因在于每個人的MHC分型是基因決定的，特定分型的MHC分子只能與結(jié)構(gòu)或分子排布互相吻合的多肽結(jié)合。根據(jù)許多現(xiàn)有的MHC分子和多肽結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)，已有研究者開發(fā)出NetMHC[12]、NetMHCpan[13]等在線預(yù)測算法。將患者外顯子測序結(jié)果分析得到的候選蛋白序列輸入預(yù)測算法，模擬計算含突變點(diǎn)的8～11個氨基酸多肽片段與該患者所有分型的MHC分子的親和力(affinity)，將預(yù)測結(jié)果<150nM的視為強(qiáng)結(jié)合(strong binding)，150～500 nM之間視為弱結(jié)合(weak binding)，>500 nM則視為不結(jié)合。對于強(qiáng)結(jié)合的多肽，可首選作為腫瘤突變特異性抗原，進(jìn)入下一步研究。結(jié)合力較弱的多肽并非代表完全不被MHC分子遞呈，為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變蛋白的遞呈，還可通過分離收集癌細(xì)胞表面的蛋白，利用LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定遞呈多肽[14]。目前已有許多預(yù)測MHC遞呈的突變抗原被實(shí)驗(yàn)證實(shí)能成為T細(xì)胞和B細(xì)胞表位[9,15-17]。從獲取患者組織，建庫進(jìn)行基因測序，到分析篩選TSMA，只是精準(zhǔn)醫(yī)療的第一步，但卻是腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的重要條件。

2 腫瘤靶向治療的有力武器——抗體偶聯(lián)藥物

樹突狀細(xì)胞疫苗[18]、T細(xì)胞免疫療法[19]、免疫檢查點(diǎn)療法[20-22]、蛋白質(zhì)、多肽以及核酸疫苗[23]等免疫療法是目前腫瘤靶向治療的幾種方案。這些方法往往需借助體內(nèi)免疫系統(tǒng)的激活、T細(xì)胞活化增殖才能發(fā)揮腫瘤殺傷作用，過程比較復(fù)雜，具有一定的滯后性。T細(xì)胞(抗原)受體(TCR)與多肽-MHC復(fù)合物的識別本身不足以激活T細(xì)胞，還需輔助刺激因子的存在。如T細(xì)胞表面的CD28分子與抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的CD80/CD86發(fā)生特異性結(jié)合，提供共刺激信號激活T細(xì)胞。CD80/CD86的表達(dá)僅限于特定的細(xì)胞類型(如APC)，而腫瘤細(xì)胞表面一般不表達(dá)此類分子，因此，T細(xì)胞療法需要誘導(dǎo)炎癥輔助治療；然而一旦體內(nèi)存在大量活化的T細(xì)胞，容易引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，威脅患者生命[24]。即便特異性T細(xì)胞得以激活，在進(jìn)入體內(nèi)后如想突破腫瘤部位的物理、生理障礙到達(dá)腫瘤細(xì)胞表面仍然十分困難。且傳統(tǒng)免疫治療的靶點(diǎn)并非真正的腫瘤特異性，也會傷及正常細(xì)胞。另一方面，單抗藥物具有靶向治療特性，其分子大小使得它們更容易到達(dá)靶細(xì)胞，且在人體內(nèi)的半衰期不是太短，為腫瘤靶向治療的好方法，其杰出代表便是抗體偶聯(lián)藥物(ADC)[25]。

ADC被喻為“生物導(dǎo)彈”，由抗體、小分子毒物(IC50在0.01～0.1 nmol/L)以及介導(dǎo)偶聯(lián)的連接物(linker)組成。小分子毒物能殺傷腫瘤細(xì)胞，也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生較大傷害，其應(yīng)用受到極大限制。ADC將小分子毒物和抗體連接起來，利用抗體將毒物靶向到靶細(xì)胞，使藥物集中在腫瘤部位，降低其他組織、器官的藥物濃度，起到增效減毒的作用[26]。目前研究常用的小分子毒物主要有海兔毒素(MMAE、MMAF)、阿霉素(DOX)、Calicheamicin、美登素(Maytansine，DM1、DM3、DM4)[27]，其他在研的小分子毒物有α-Amanitin、Tubulysins[28]、pyrrolobenzo-diazepines(PBDs)、duocarmycin、centanamycin和喜樹堿類(SN38)[29]等。小分子毒物本身往往不能直接和linker通過化學(xué)鍵鏈接，需要先進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，在適當(dāng)?shù)奈恢锰砑踊瘜W(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)，如-NH2、-SH、-OH、-COOH等。而抗體主要通過氨基酸側(cè)鏈的賴氨酸-NH2和游離半胱氨酸-SH與linker鏈接。連接抗體與毒性藥物的連接物包括可斷開的(cleavable)連接物(肽連接、二硫鍵連接、腙連接)和不可斷開的(non-cleavable)連接物(硫醚連接)[30]。linker的功能不僅僅是連接作用，還應(yīng)維持ADC在細(xì)胞外的穩(wěn)定，且進(jìn)入癌細(xì)胞后能迅速水解釋放出小分子藥物發(fā)揮藥效，實(shí)現(xiàn)快速清除靶細(xì)胞的目的。對于不同的靶細(xì)胞和藥物，根據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)篩選出適合的連接方式十分重要。通常來說，美登素-抗體偶聯(lián)物采用二硫鍵或者硫醚連接[31]，海兔毒素-抗體偶聯(lián)物的linker是能在溶酶體里被酶切的肽連接或者是不可斷開的硫醚連接[32]，Calicheamicin-抗體偶聯(lián)物采用對酸敏感的腙連接。一般認(rèn)為，肽連接通過MC-Val-Cit-PABC連接物連接而成，其在細(xì)胞內(nèi)的裂解方式是ADC在血清和中性pH里穩(wěn)定，但在溶酶體或組織蛋白酶B(cathepsin-B)里迅速斷開釋放藥物，也可能被核內(nèi)體和細(xì)胞質(zhì)蛋白酶水解。二硫鍵連接利用從抗體還原而成的半胱氨酸巰基與帶有巰基的藥物連接而成。胞內(nèi)最為豐富的硫醇還原型谷胱甘肽濃度在1～10 mM，是胞外血液含量最多的硫醇半胱氨酸的1000倍，因此二硫鍵linker進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)能迅速被水解；細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族也可能參與二硫鍵linker的分解。腙連接通過含酰肼結(jié)構(gòu)的藥物與包含腙鍵與二硫的4-(4-乙酰苯氧)丁酸(AcBut)連接物連接而成，其裂解方式為經(jīng)酸催化的水解反應(yīng)斷裂，在細(xì)胞外近中性(pH 7.3～pH 7.5)的體循環(huán)和其他部位中能保持完整性，而在酸性的晚期核內(nèi)體(pH 5.0～pH 6.5)和溶酶體(pH 4.5～pH 5.0)中可被水解。硫醚連接通過抗體在細(xì)胞溶酶體內(nèi)降解，釋放出帶有偶聯(lián)部位氨基酸的藥物。

近年來通過定點(diǎn)突變的方法，在不影響抗體親和性的條件下，定點(diǎn)突變出游離的半胱氨酸，突出游離巰基，一般將Ser突變成Cys，實(shí)現(xiàn)特定的藥物抗體偶聯(lián)比(drug-to-antibody ratio，DAR)[33]。Tian等[34]通過突變出非天然氨基酸如p-AF/p-AZ，通過苯丙氨酸伸出抗體外側(cè)的側(cè)鏈，能很好地與藥物偶聯(lián)。李朝輝等[35]根據(jù)Jagath等[33]的方法，將抗CD20抗體OFA(Ofatumumab)的重鏈恒定區(qū)第1位的氨基酸A變成C，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測，突變體保持了原抗體OFA的活性，即親和性、補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗體依賴細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性。突變后伸出游離半胱氨酸作為活性基團(tuán)定點(diǎn)偶聯(lián)vcMMAE，突變體偶聯(lián)產(chǎn)物也保持了原抗體的親和性、CDC、ADCC和穩(wěn)定性，且體內(nèi)外細(xì)胞毒性都比原抗體明顯提高。除了化學(xué)偶聯(lián)方法，利用Sortase A轉(zhuǎn)肽酶[36]、糖基轉(zhuǎn)移酶[37]、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶[30]等酶促反應(yīng)的偶聯(lián)方法也逐漸發(fā)展起來。Sortase A酶是細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)的一種轉(zhuǎn)肽酶，可以識別蛋白C端的LPETG結(jié)構(gòu)域，使LPETG結(jié)構(gòu)在蘇氨酸和甘氨酸處斷裂，再與甘氨酸修飾的小分子連接來制備ADC。Beerli等[36]成功通過酶促法將帶LPETG標(biāo)簽修飾的抗體與小分子vcMMAE偶聯(lián)起來。傳統(tǒng)的化學(xué)偶聯(lián)方法主要通過抗體-NH2和-OH與小分子偶聯(lián)，無法準(zhǔn)確控制DAR，而定點(diǎn)突變偶聯(lián)在不破壞抗體內(nèi)部二硫鍵的前提下可以實(shí)現(xiàn)均一的DAR，相對而言，酶促法通過酶特異的識別序列，反應(yīng)條件溫和，不破壞抗體結(jié)構(gòu)，且可定量控制抗體載藥量，能很好的實(shí)現(xiàn)ADC均一性，從而更好地控制劑量，保證藥物療效和安全性。

目前臨床使用的抗體偶聯(lián)藥物T-DM1，基于EMILIA(TDM4370g/BO21977)的研究結(jié)果，于2013年獲得美國食品和藥物管理局(FDA)優(yōu)先審評批準(zhǔn)上市。EMILIA是一項(xiàng)在全球范圍進(jìn)行的隨機(jī)性、開放性III期臨床研究，針對991位接受過曲妥珠單抗及紫杉醇類藥物化療的局部晚期乳腺癌患者或者轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，與拉帕替尼+卡培他濱聯(lián)合用藥治療方法相比，T-DM1治療的患者中位總生存期延長5.8個月，死亡風(fēng)險下降32%，嚴(yán)重不良反應(yīng)出現(xiàn)率更低[38]。上市后用于治療HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，其獨(dú)特的療效受到臨床醫(yī)生、科研人員和患者的廣泛關(guān)注，也推動了腫瘤靶向治療進(jìn)入新階段。此外，T-DM1用于治療早期乳腺癌[39-40]、二線用于晚期HER2陽性的胃癌臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中[41-42]。

3 腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的重要突破口——個性化抗體偶聯(lián)藥物

T-DM1的成功為ADC的發(fā)展提供了強(qiáng)大動力，現(xiàn)今進(jìn)入臨床研究階段的抗體偶聯(lián)藥物已達(dá)30余種[27,43]。但普通的ADC針對的靶點(diǎn)僅僅是癌細(xì)胞高表達(dá)，正常細(xì)胞低表達(dá)，屬于“量”上的差異，因此這類ADC也會“誤傷”正常細(xì)胞，不能滿足腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的要求。開發(fā)腫瘤特異性抗體，為患者制備個性化抗體偶聯(lián)藥物(PADC)能很好地克服藥物非特異性帶來的副作用。PADC所采用的抗體是針對腫瘤體細(xì)胞突變產(chǎn)生的特異性抗原(即TSMA)，正常細(xì)胞不存在該突變抗原，其靶點(diǎn)屬于“質(zhì)”上的差異，因此抗體能精確靶向癌細(xì)胞。目前研究者們不但可以根據(jù)目的蛋白或者短肽制備特異性抗體，還可以針對蛋白單個氨基酸突變或者小片段氨基酸序列變化來制備突變特異性抗體[17,44]。筆者實(shí)驗(yàn)室致力于通過對患者進(jìn)行基因測序篩選得到TSMA用作抗原，制備突變特異性抗體，再通過抗體偶聯(lián)技術(shù)制備腫瘤細(xì)胞特異性的PADC，為腫瘤患者開發(fā)個性化的精準(zhǔn)治療方案。

突變特異性抗體的獲取方法主要有噬菌體展示技術(shù)和雜交瘤技術(shù)2種。噬菌體展示技術(shù)最早在1985年由Smith GP提出，是一項(xiàng)利用親和結(jié)合篩選特異性多肽或蛋白的技術(shù)[45]。將隨機(jī)序列的多肽或蛋白基因片段與絲狀噬菌體外殼蛋白基因融合構(gòu)建噬菌體文庫，異源分子隨噬菌體衣殼蛋白表達(dá)而展示于病毒表面并能保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)，使其能夠與靶分子配體結(jié)合而達(dá)到模擬篩選特異性分子表位的作用，且展示的異源分子可在E.coli中大量表達(dá)，從而提供了高通量高效率的篩選系統(tǒng)?？贵w庫(ScFv或Fab)的構(gòu)建是噬菌體展示技術(shù)篩選新抗體的關(guān)鍵，全人源抗體是當(dāng)今治療性抗體的主流，它可以減少因物種差異帶來的免疫排斥反應(yīng)[46]。構(gòu)建好的噬菌體抗體庫可用于快速篩選出特異性抗體，是流行病[47]和腫瘤個性化治療的有效手段。通過構(gòu)建大容量全人源天然抗體庫，理論上可以針對任何抗原篩選出人源性抗體。以篩選得到的TSMA為固定相靶點(diǎn)，經(jīng)過幾輪“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的體外篩選富集，篩選出具有高親和性高特異性的抗體[48]。噬菌體展示技術(shù)所得抗體并非完整抗體，因此通過基因工程技術(shù)可組裝成完整抗體，用于制備PADC[49]?？乖庖咝∈笾苽潆s交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體也是產(chǎn)生特異性抗體的有效方法，該技術(shù)采用的2種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。前者具有抗體分泌功能，但在體外不能長期生長；而后者可在體外培養(yǎng)無限分裂增殖，2者雜交融合，形成在體外能無限分裂增殖并產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞[50]。以TSMA為免疫抗原，從雜交瘤細(xì)胞群中挑選出可分泌對TSMA特異性識別的單克隆抗體細(xì)胞株，后期可經(jīng)過抗體人源化改造保留抗體活性并減少異源性。

特異性單克隆抗體的制備是PADC的首要任務(wù)，也是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抗體對突變新抗原的特異性和親和力直接關(guān)系到PADC抗腫瘤效果的好壞。目前主要通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，基于表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)開發(fā)的生物分析傳感技術(shù)BIAcore、基于生物膜干涉技術(shù)(BioLayer interferometry technology，BLI)開發(fā)的生物分子相互作用檢測技術(shù)Fortebio和流式細(xì)胞術(shù)等評價抗體對抗原的親和性能[51]，同時設(shè)置同型對照、陰性對照評價抗體特異性。突變特異性抗體能特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，其靶點(diǎn)不局限于突變遞呈多肽，細(xì)胞膜蛋白胞外區(qū)的突變也能識別。到達(dá)靶細(xì)胞的PADC通過抗體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入癌細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)降解，釋放出細(xì)胞毒物?；蛟诎┘?xì)胞間隙中降解，釋放出來的小分子毒物再進(jìn)入癌細(xì)胞，最終發(fā)揮毒性作用殺死癌細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)有效的腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療[52-53]。

4 結(jié)語

隨著“組學(xué)”技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)的應(yīng)用，人們對腫瘤的認(rèn)識不斷深入、不斷精確，精準(zhǔn)醫(yī)療是建立在對人、病、藥物深度認(rèn)識基礎(chǔ)上的高水平醫(yī)療技術(shù)，應(yīng)用于腫瘤靶向治療已是大勢所趨。PADC結(jié)合抗體絕對特異性靶向和小分子毒物強(qiáng)大的細(xì)胞殺傷力這兩個特性，同時保留抗體ADCC、CDC作用，可謂“一彈多頭”。T-DM1的成功使ADC成為全球靶向藥物的“新寵”；而PADC能快速定點(diǎn)消除癌細(xì)胞，為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療帶來了新希望，其獨(dú)特的治療優(yōu)勢必然使之成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療新時代的重要手段。

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(編校：吳茜)

Personalized antibody-drug conjugates: a means of tumor precision medicine

WEI Xiao-yue, ZHOU Zhan, CHEN Shu-qingΔ

(College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Somatic mutation is a key factor for tumorigenesis and tumor heterogeneity, which is not fully utilized by traditional methods of malignant tumor treatment. Precision medicine means accurate diagnosis and applyment of targeted drugs to treat diseases with the help of informatics and medical technology, which based on deeply understanding of individual genomic and somatic mutation information. This is a novel model of personalized medicine, and its clinical benefits in the treatment of malignant tumors are being increasingly demonstrated. Somatic mutations endow cancer cells with specific antigens that are perfect target for antibody drugs. Personalized antibody-drug conjugates(PADCs) combine cytotoxic anticancer drugs with mutation special antibodies and are different from ordinary ADCs. PADCs target specifically to mutation antigens, without any cross-binding to normal cells. PADCs can deliver cytotoxic drugs to cancer cells specifically, achieving synergistic and attenuated effect for cancer therapy, which makes PADCs an important means of tumor precision medicine. This paper aims to outline the tumor specific antigens generated by somatic mutations, the discovery of neo-antigens, the preparation of specific antibodies and PADCs, and how PADCs kill cancer cells. The bright future of PADCs as a strategy in tumor precision medicine is described.

somatic mutation; precision medicine; tumor-specific mutant antigens; personalized antibody-drug conjugate

韋小越，女，博士在讀，研究方向：腫瘤特異性抗體及ADC研究，E-mail：11319017@zju.edu.cn；陳樞青，通信作者，男，博士，教授，研究方向：精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)藥物，E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn。

R730.1

A

1005-1678(2016)01-0001-06