官玲亮 夏奇峰 龐玉新 趙致 胡遠(yuǎn)鵬 白琳 王鴻發(fā)

[摘要]為了全面了解艾納香中萜類物質(zhì)的代謝途徑，以及具體的基因和催化酶類，以期為從分子水平調(diào)控艾納香中萜類活性成分提供理論依據(jù)?；诎{香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將艾納香的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果同KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中其他多種高等植物萜類合成途徑的研究結(jié)論進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)出艾納香中萜類代謝的具體途徑。結(jié)果表明艾納香在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)上4條萜類代謝通路：萜類骨架代謝途徑、單萜代謝途徑、二萜代謝途徑、倍半萜與三萜代謝途徑，對(duì)應(yīng)基因的數(shù)目分別為103，10，29，59條。通過對(duì)催化酶與活性產(chǎn)物進(jìn)行總結(jié)分析，結(jié)果顯示，單萜活性產(chǎn)物為8種、二萜3種、三萜和倍半萜3種。在萜類代謝途徑過程中的關(guān)鍵酶主要為脫氧木酮糖5磷酸合酶、HMGCoA還原酶、烯丙基轉(zhuǎn)移酶系。艾納香中與單萜類物質(zhì)合成的酶類相對(duì)較少，而產(chǎn)物種類較多，這可能與單萜合酶催化產(chǎn)物的不專一性有關(guān)。通過對(duì)艾納香中萜類調(diào)控途徑的整體分析，并對(duì)其中關(guān)鍵酶基因的調(diào)控，有望整體提高艾納香中萜類活性物質(zhì)的產(chǎn)量。

[關(guān)鍵詞]艾納香；轉(zhuǎn)錄組；萜類代謝途徑；限速酶

[Abstract]In order to provide a theoretical basis for the regulation of active ingredient， the terpenoids metabolic pathway and specific enzymes in Blumea balsamifera are investigated Basing on transcriptome information， B balsamifera terpenoids metabolic pathway was analyzed in KEGG data base Four metabolic pathway of terpenoids were found in KEGG data base They were terpenoid backbone biosynthesis， monoterpenoid biosynthesis， diterpenoid biosynthesis， sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis， contained 103， 10， 29，59 genes， respectively Through the analysis of the enzyme and product in the pathway， the result showed that there were 8 kinds of monoterpenes， 3 kinds of diterpenes， 3 kinds of triterpenes and sesquiterpenes The mainly key enzymes were deoxyxylulose 5phosphate synthase， HMGCoA reductase and allyl transferase system In B balsamifera， there were relatively few monoterpenes synthetic enzymes， while the type of products was much more than other terpenes This may be relate to the nonspecific catalytic characteristic of monoterpene synthase It is expected to improve the yield of terpenoids in B balsamifera by analysis the pathways and regulation the key enzymes

[Key words]Blumea balsamifera； transcription group； metabolic pathway of terpenoids； ratelimiting enzyme

doi：104268/cjcmm20160903

艾納香Blumea balsamifera L.DC.為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，最早記載于公元741年（唐開元二十九年）陳藏器所編著 《本草拾遺》，此后宋代劉翰等編著《開寶本草》（公元 973—974 年）也曾記載[1]。艾納香以根、嫩枝、葉入藥，其性微溫，味辛、微苦，具有祛風(fēng)消腫、活血散瘀之功效，可用于治療感冒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后風(fēng)痛、痛經(jīng)、 外用跌打損傷、瘡癤痛腫、濕疹皮炎。另外，艾納香還具有抗氧化、抗癌和抗病毒的作用[2]。主要分布于我國(guó)海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺(tái)灣等省。在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的藥用歷史，是一種重要的民間藥物[3]。

萜類化合物（terpenoids）是植物體內(nèi)一大類由異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單位所組成的化合物，萜類物質(zhì)是自然界種類最多、分布最廣泛的一類天然產(chǎn)物[45]。前人的研究成果顯示，目前在自然界已發(fā)現(xiàn)的萜類物質(zhì)有近3萬種之多，其中有一半的物質(zhì)是在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[6]。植物體內(nèi)的萜類化合物大多與植物的代謝過程密切相關(guān)，對(duì)植物的正常生理活動(dòng)發(fā)揮著重要的作用。從萜類的化學(xué)結(jié)構(gòu)上可以將其分為單萜、二萜、倍半萜、三萜等類別[7]。植物體內(nèi)的萜類物質(zhì)除了對(duì)植物體本身具有重要作用之外，有許多的萜類物質(zhì)還具有巨大的藥用價(jià)值，是許多中藥材的藥理活性成分[810]。比如，抗腫瘤的紫杉醇、長(zhǎng)春新堿；抗瘧的青蒿素；主要能阻斷副交感神經(jīng)節(jié)后纖維的托品類生物堿等。左旋龍腦（L龍腦）又名艾片，是艾納香中重要的次生代謝產(chǎn)物，是艾納香主要的藥用活性成分，L龍腦屬于雙環(huán)單萜化合物[11]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，L龍腦具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)藥物吸收、提神醒腦等作用[12]。

本文基于艾納香的轉(zhuǎn)錄組信息，將艾納香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索比對(duì)，找到并進(jìn)一步梳理了艾納香中萜類物質(zhì)的生物合成途徑。對(duì)艾納香中萜類合成具體步驟進(jìn)行了具體的分析，對(duì)位到了每一個(gè)反應(yīng)步驟的催化酶。將艾納香轉(zhuǎn)錄組的基因信息與酶的表達(dá)合成聯(lián)系起來，有望在將來從分子調(diào)控的水平對(duì)艾納香萜類代謝的過程進(jìn)行調(diào)控，提高艾納香萜類活性物質(zhì)的生物合成量，從而增大艾納香的藥用價(jià)值。

1材料

艾納香B. balsamifera栽培于海南省儋州市，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所南藥種質(zhì)資源圃，根據(jù)前期對(duì)艾納香全年不同月份，葉片中L龍腦的含量進(jìn)行的研究結(jié)果，顯示在6月和11月為L(zhǎng)龍腦積累的高峰期，為此本研究中試驗(yàn)材料選取的為6月份艾納香長(zhǎng)勢(shì)良好的成熟葉片。

2方法

用總RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）提取艾納香葉片的總RNA，由上海美吉（Majorbio）生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。實(shí)驗(yàn)采用 Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit 方法構(gòu)建文庫(kù)，真核生物以 5 μg total RNA 起始量建庫(kù)；磁珠法分離 mRNA后，離子打斷 mRNA（TruseqTM RNA sample prep Kit）；雙鏈 cDNA合成、補(bǔ)平、3′端加 A、連接 index 接頭（TruseqTM RNA sample prep Kit）；文庫(kù)富集，PCR擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；2%瓊脂糖膠回收目的條帶（Certified Low Range Ultra Agarose）；TBS380（Picogreen）定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)；cBot上進(jìn)行橋式 PCR擴(kuò)增，生成clusters；Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。數(shù)據(jù)分析流程如下：數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)、數(shù)據(jù)去雜、轉(zhuǎn)錄組拼接、SSR分析及SNP分析、基因功能注釋等。本文基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息以及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，對(duì)艾納香的萜類代謝代謝途徑進(jìn)行了整理與分析。

3結(jié)果與分析

31轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果本研究以艾納香長(zhǎng)勢(shì)良好的成熟葉片為材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行除雜之后，共獲得98 341 536個(gè)reads片段，包含了8 477 385 401個(gè)核苷酸序列信息；將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行de novo拼接，得到了100 341個(gè)Unigene片段。Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)表明，艾納香葉片轉(zhuǎn)錄組中的Unigene根據(jù)功能可以大致分為25類；根據(jù)GO功能大致可分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類43分支；利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)作為參考，依據(jù)代謝通路可以將轉(zhuǎn)錄組中的數(shù)據(jù)分成111類，包括生化代謝通路、植物病原體互作、DNA剪切、植物激素生物合成、苯丙氨酸生物合成、萜類化合物與類固醇類化合物合成、脂類代謝、RNA降解等。

32代謝途徑與涉及基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果顯示，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析之后，艾納香中與萜類相關(guān)的代謝通路有4條，分別是：萜類骨架代謝途徑，編號(hào)為Ko00900，艾納香轉(zhuǎn)錄組中與之相關(guān)的基因有103條；單萜代謝途徑，編號(hào)為Ko00902，艾納香轉(zhuǎn)錄組中與之相關(guān)的基因有10條；二萜代謝途徑，編號(hào)為Ko00904，艾納香轉(zhuǎn)錄組中與之相關(guān)的基因有29條；倍半萜與三萜代謝途徑，編號(hào)為Ko00909，艾納香轉(zhuǎn)錄組中與之相關(guān)的基因有59條。艾納香中主要的酶與酶的功能、酶所涉及基因數(shù)目見表1。

官玲亮等：艾納香萜類物質(zhì)生物合成途徑分析表1艾納香萜類代謝途徑的酶與相關(guān)基因

Table 1Metabolic pathway of terpenoids and genes in Blumea balsamifera

代謝途徑途徑編號(hào)總基因數(shù)量主要酶與酶編號(hào)酶涉及基因數(shù)目酶的功能萜類骨架生物合成Ko00900103乙酰CoA轉(zhuǎn)乙?；福↘00626）6催化乙?；D(zhuǎn)移，介導(dǎo)乙酰CoA與乙酰乙酰CoA的互變HMGCoA合酶（K01641）4催化三分子乙酰CoA聚合生成HMGCoAHMGCoA還原酶（K00021）7以NADPH為輔酶，催化HMGCoA發(fā)生加氫還原反應(yīng)甲羥戊酸激酶（K00869）2催化甲羥戊酸磷酸化磷酸甲羥戊酸激酶（K00938）3催化磷酸甲羥戊酸磷酸化，形成焦磷酸甲羥戊酸異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（K01823）2催化IPP與DMAPP轉(zhuǎn)化互變焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（K01597）1催化焦磷酸甲羥戊酸脫羧生成IPP1脫氧木酮糖5磷酸合酶（K01662）25催化3磷酸甘油醛與丙酮酸合成1脫氧木酮糖5磷酸1脫氧木酮糖5磷酸還原酶（K00099）3催化氫化還原反應(yīng)磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶（K00991）2催化胞苷轉(zhuǎn)移形成糖苷磷酸胞苷二甲基赤蘚醇激酶（K00919）1催化底物磷酸化2甲基D赤蘚醇2，4環(huán)磷酸合酶（K01770）1催化2甲基D赤蘚醇2，4環(huán)磷酸合成4羥基3甲基2己烯焦磷酸合酶（K03526）1催化底物焦磷酸化4羥基3甲基2己烯焦磷酸還原酶（K03527）4催化底物氫化還原異戊二烯合酶（K12742）5催化異戊二烯合成法尼烯焦磷酸合酶（FDPS）（K00787）5催化法尼烯焦磷酸合成香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPS）（K13789）4催化香葉基香葉基焦磷酸合成香葉基焦磷酸合酶（GPS/GPPS）1催化香葉基焦磷酸合成單萜代謝Ko0090210（3S）芳樟醇合酶（K15086）4催化芳樟醇合成新薄荷醇脫氫酶（K15095）6催化脫氫氧化反應(yīng)二萜代謝Ko0090429柯巴基焦磷酸合酶（K04120）4催化合成柯巴基焦磷酸對(duì)映貝殼杉烯合酶（K04121）1催化貝殼杉烯合成貝殼杉烯酸羥化酶（K04123）1合成赤霉素類物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，赤霉素是重要的二萜類激素三萜倍半萜Ko0090959法尼酰二磷酸酯法尼?；D(zhuǎn)移酶（K00801）5催化原角鯊烯二磷酸合成鯊烯單加氧酶（K00511）12催化合成環(huán)氧角鯊烯，其為各種三萜、倍半萜類化合物的前體物質(zhì)

33萜類骨架代謝途徑分析基于前人對(duì)大量植物萜類物質(zhì)生物合成途徑的研究，發(fā)現(xiàn)萜類物質(zhì)基本骨架的生物合成途徑都是大體相似的。在植物體中，異戊烯焦磷酸（IPP）與二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）的生物合成途徑被稱為萜類物質(zhì)的骨架合成途徑。在高等植物不同物種中，萜類物質(zhì)總骨架的生物合成途徑大體相似，都可以從2條途徑合成IPP與DMAPP，分別是甲羥戊酸途徑與脫氧木酮糖5磷酸途徑[13]。脫氧木酮糖5磷酸途徑研究得相對(duì)比較少，該途徑是在植物的質(zhì)體（葉綠體、有色質(zhì)體、白質(zhì)體）內(nèi)發(fā)生的，以丙酮酸和磷酸甘油醛原料，在轉(zhuǎn)酮酶的催化作用下聚合生成脫氧木酮糖5磷酸。IPP在異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的催化下轉(zhuǎn)化為二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在甲羥戊酸途徑與脫氧木酮糖5磷酸途徑中，IPP與DMAPP一起都被稱為“活性異戊二烯”，是萜類合成真正的前體[14]。香葉基焦磷酸合成酶（GPPS）催化1分子IPP和1分子DMAPP合成香葉基焦磷酸（GPP），香葉基焦磷酸又被稱為牻牛兒基焦磷酸。GPP與單萜的生物合成密切相關(guān)，芳樟醇合酶催化GPP生成芳樟醇，在芳樟醇的基礎(chǔ)上合成一系列單萜化合物。法尼基焦磷酸合酶（FDPS）催化GPP生成法尼基焦磷酸（FPP），F(xiàn)PP又在香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPS）的催化下合成了香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）。萜類骨架合成途徑見圖1。

34單萜生物合成途徑分析單萜（monoterpenoids）是指由二分子異戊二烯聚合而成的萜類化合物及其含氧衍生物。單萜按分子的基本碳骨架可分為：無環(huán)單萜、單環(huán)單萜、雙環(huán)單萜及三環(huán)單萜4大類[15]。本次分析顯示在艾納香中與單萜合成相關(guān)的基因最少，僅有10條基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)上。單萜類物質(zhì)是萜類家族中結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的物質(zhì)，單萜類物質(zhì)一般的特點(diǎn)是分子量較小、種類較多。因此導(dǎo)致催化單萜類物質(zhì)合成的酶在催化活性上的專一性較低，其專一性不如其他催化結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高級(jí)萜類合成的酶高。單萜合酶在不同的植物種類中催化合成的單萜類物質(zhì)種類差別較大，這也體現(xiàn)了單萜類物質(zhì)在不同植物中的個(gè)性差異。因此，艾納香中單萜合酶基因種類少，并不意味著就是單萜物質(zhì)種類或含量少。龐玉新等[13]分析了艾納香中包含的物質(zhì)種類，通過化學(xué)分析證明艾納香中含有21種單萜類物質(zhì)，其中包括了左旋龍腦（L龍腦）、異龍腦、檸烯外消旋體、蒎烯等物質(zhì)。艾納香中主要的單萜類物質(zhì)見圖3。

35二萜生物合成途徑分析二萜（diterpenoid）是含有4個(gè)異戊二烯單位的萜類化合物[15]。香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPS）催化法尼基焦磷酸合成的香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）與二萜的生物合成關(guān)系密切，合成的二萜類化合物主要是赤霉素（GA），GA是高等植物體內(nèi)廣泛存在的植物激素，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于二萜類酸，是植物體內(nèi)極為重要的一大類二萜化合物。二萜的合成途徑見圖4。

其中，赤霉素（GA）是一大類物質(zhì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的赤霉素有38種，相互之間具有同樣的基本結(jié)構(gòu)，僅僅是局部化學(xué)基團(tuán)的修飾造成彼此的差異。以赤霉素A12的結(jié)構(gòu)作為代表。

36三萜、倍半萜生物合成途徑分析三萜（triterpenoid）由30個(gè)碳原子構(gòu)成基本碳架，大多數(shù)可看作是由6個(gè)異戊二烯單體聯(lián)結(jié)而成；倍半萜（sesquiterpenes）是指分子中含15個(gè)碳原子的天然萜類化合物[1516]。法尼基焦磷酸（FPP）與三萜、倍半萜生物合成密切相關(guān)，F(xiàn)PP在法尼酰二磷酸酯法尼酰基轉(zhuǎn)移酶的催化下合成原角鯊烯二磷酸、鯊烯，鯊烯又在鯊烯單加氧酶的催化下合成環(huán)氧角鯊烯，鯊烯和環(huán)氧角鯊烯能夠轉(zhuǎn)化為各種三萜、倍半萜類化合物，合成途徑見圖5。

37艾納香萜類合成途徑中的關(guān)鍵酶分析由于萜類結(jié)構(gòu)各異種類復(fù)雜，所以萜類合成相關(guān)的酶數(shù)量繁多。但是在萜類合成相關(guān)的眾多酶當(dāng)中，前人對(duì)萜類骨架合成的酶研究得相對(duì)透徹。萜類骨架合成途徑有甲羥戊酸途徑脫氧木酮糖5磷酸途徑，目前科研工作者對(duì)催化甲羥戊酸途徑發(fā)生的酶研究得相對(duì)深入，而對(duì)催化木酮糖5磷酸途徑發(fā)生的酶卻知之甚少[17]。

在脫氧木酮糖5磷酸途徑中，脫氧木酮糖5磷酸合酶是研究得相對(duì)較多的酶，它以維生素B1作為輔酶，催化丙酮酸與3磷酸甘油醛縮合形成脫氧木酮糖5磷酸，它也是在植物萜類合成途徑中相對(duì)重要的一個(gè)酶。在甲羥戊酸途徑中，甲羥戊酸是在HMGCoA還原酶的催化下合成的，熱力學(xué)分析表明甲羥戊酸生成的過程是一個(gè)不可逆的過程，所以HMGCoA還原酶是萜類合成的限速酶[17]，是萜類合成重要的調(diào)控位點(diǎn)。HMGCoA還原酶是一個(gè)基因家族，在植物體中多拷貝。

烯丙基轉(zhuǎn)移酶系也是萜類合成途徑中的關(guān)鍵酶。烯丙基轉(zhuǎn)移酶系是由基因超家族編碼合成的酶，其中包括香葉基焦磷酸合成酶（GPPS）、法尼基焦磷酸合成酶（FDPS）、香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPS）。GGPS是二萜合成途徑的重要控制位點(diǎn)，而GPPS是僅次于HMGCoA還原酶的第二個(gè)限速酶。

4結(jié)論與討論

本研究是基于艾納香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將艾納香的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果同KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中科研工作者對(duì)其他多種高等植物萜類合成途徑研究得出的所有結(jié)論進(jìn)行比對(duì)，從很大程度上能夠預(yù)測(cè)出艾納香中萜類代謝的具體途徑。從基因比對(duì)上的條數(shù)可以推測(cè)艾納香中單萜類物質(zhì)的合成可能相對(duì)較少（比對(duì)上的基因條數(shù)最少僅有10條），而二萜、三萜、倍半萜的合成相對(duì)豐富。

由于單萜類物質(zhì)種類的復(fù)雜性，導(dǎo)致催化單萜類物質(zhì)合成的酶在催化活性上的專一性較低，其專一性不如其他催化結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高級(jí)萜類合成的酶高。單萜合酶在不同的植物種類中催化合成的單萜類物質(zhì)種類差別較大，這也體現(xiàn)了單萜類物質(zhì)在不同植物中的個(gè)性差異。被子植物單萜合酶基因系統(tǒng)發(fā)育和譜系分化與植物的自然分類系統(tǒng)有較緊密聯(lián)系，與其功能即催化產(chǎn)物種類沒有必然聯(lián)系。相同物種來源的單萜合酶基因間的相似性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同物種來源而具有相同功能的單萜合酶基因，盡管前者催化產(chǎn)物不同。前期研究工作表明，同科屬植物的單萜合酶通常被聚為一類，如唇型科Lamiaceae紫蘇屬、薄荷屬和鼠尾草屬等都聚為一類。因此，單萜合酶基因進(jìn)化頻率較高，基于序列相似性僅可粗略推測(cè)該基因是否屬于單萜合酶，卻不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其產(chǎn)物。根據(jù)前人對(duì)艾納香活性成分的研究，可以確定左旋龍腦（L龍腦）是艾納香中的主要活性成分，對(duì)L龍腦的波譜分析顯示L龍腦是雙環(huán)單萜類化合物。本研究中，檢測(cè)到單萜合酶基因10條，可能與L龍腦的合成有關(guān)。目前本課題組正在對(duì)艾納香單萜合酶基因的功能進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明艾納香中萜類骨架生物合成的途徑與其他物種中的合成途徑大體相似，在艾納香中也預(yù)測(cè)到甲羥戊酸途徑與木酮糖5磷酸途徑。根據(jù)其他多種植物目前的研究成果推測(cè)，艾納香萜類骨架生物合成途徑中的限速酶很可能也是HMGCoA還原酶與香葉基焦磷酸合酶（GPPS），GPPS屬于烯丙基轉(zhuǎn)移酶超家族的成員，其中還包括了法尼基焦磷酸合酶（FDPS）和香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPS），F(xiàn)DPS是與三萜倍半萜合成密切相關(guān)的酶，GGPS是與二萜合成密切相關(guān)的酶。從分子生物學(xué)的角度，HMGCoA還原酶，GPPS，F(xiàn)DPS，GGPS可以成為分子調(diào)控的重要靶點(diǎn)，有望從分子水平提高艾納香中萜類活性物質(zhì)的生物合成產(chǎn)量，從而提高艾納香的藥用價(jià)值。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]