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        水溶性的PEI化殼聚糖的合成

        2016-07-09 13:23:05陶鳳
        關(guān)鍵詞:聚乙二醇殼聚糖改性

        陶鳳

        摘 要:殼聚糖是天然聚多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物,具有生物兼容性、生物降解性、無(wú)毒性。作為天然陽(yáng)離子聚合物,殼聚糖具有正電性和特殊性能,因而殼聚糖及其衍生物可廣泛用作藥物和基因載體。但是其水溶性不好,單純殼聚糖轉(zhuǎn)染效率也不高,這就大大限制其應(yīng)用范圍。為了提高殼聚糖的溶解性和轉(zhuǎn)染效率,對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾極其必要。聚乙二醇能夠有效提高水溶性,當(dāng)其與藥物相連時(shí)能增大分子量,減少腎消除延長(zhǎng)半衰期,增加藥物穩(wěn)定性,并且PEG鏈包裹在藥物表面,能夠遮蔽藥物的抗原,降低藥物的免疫原性。我們通過(guò)合成了O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖衍生物。合成的最終產(chǎn)物,不僅提高殼聚糖的水溶性和穩(wěn)定性,提高轉(zhuǎn)染效率,而且由于引入大量的活性氨基,則便于殼聚糖的進(jìn)一步修飾。反應(yīng)合成的中間體和最終產(chǎn)物都通過(guò)1HNMR和FTIR表征。

        關(guān)鍵詞:殼聚糖;基因載體;改性;聚乙二醇;聚乙烯亞胺

        中圖分類號(hào):O636 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        殼聚糖是天然聚多糖甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物,具有生物兼容性、生物降解性、無(wú)毒性。作為天然陽(yáng)離子聚合物,殼聚糖具有正電性和特殊性能,因而殼聚糖及其衍生物可廣泛用作藥物和基因載體。但是其水溶性不好,則大大限制其應(yīng)用范圍。為此本課題通過(guò)對(duì)殼聚糖的修飾,旨在提高其水溶性。與此同時(shí),殼聚糖作為基因載體,其轉(zhuǎn)染效率也不太理想。為此我們也通過(guò)對(duì)殼聚糖的修飾,提高含氮量來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率。所以,通過(guò)修飾得到的殼聚糖衍生物水溶性好,轉(zhuǎn)染效率高,穩(wěn)定性好,免疫原性低,可作為更加理想的基因載體使用。

        1 水溶性的PEI化殼聚糖的合成實(shí)驗(yàn)

        在水溶性的PEI化殼聚糖的合成實(shí)驗(yàn)中主要使用的是分子量2000的聚乙二醇單甲醚,當(dāng)聚乙二醇與藥物相連時(shí),能夠增大藥物的分子量,減少腎消除延長(zhǎng)半衰期,增加藥物穩(wěn)定性,并且PEG鏈包裹在藥物表面,能夠遮蔽藥物的抗原,降低藥物的免疫原性。

        1.1 實(shí)驗(yàn)合成路線

        通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱,為合成目標(biāo)產(chǎn)物O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖(mPEG-CS-N-MA-PEI),設(shè)計(jì)了如下的合成路線。首先完成碘代聚乙二醇單甲醚的合成,而后完成N-鄰苯二甲酸酐殼聚糖的合成,再次依次完成O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖的合成、O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐殼聚糖的合成、O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖的合成等。

        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

        NMR:Bruker AV400型核磁共振儀,真空泵(SHZ(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵),F(xiàn)T-IR:Perkin-Elmer 2000型紅外光譜儀(KBr壓片),真空干燥箱(DZF-150型),加熱攪拌器(DF-10B集熱恒溫磁力攪拌器),水泵(SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5299),透析袋(截留分子量為8000-14000,北京索萊寶科技公司)。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

        殼聚糖:南京衛(wèi)康生物制品有限公司,脫乙酰度>90%,分子量48KDa;聚乙二醇單甲醚(mPEG):韓國(guó)Hannong化學(xué)公司,分子量2KDa;聚乙烯亞胺(PEI):武漢強(qiáng)龍化工有限公司,分子量2KDa;馬來(lái)酸酐:成都市科龍化工試劑廠,含量99.5%;亞磷酸三苯酯:成都市科龍化工試劑廠,含量98.0%;CH3I,DMSO,甲苯,乙醚,成都市科龍化工試劑廠。

        1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

        1.3.1 碘代聚乙二醇單甲醚(mPEGI)的制備

        稱取10g MPEG加入50mL三頸燒瓶中,再加入1.3mL亞磷酸三苯酯和0.6mL碘甲烷,在氮?dú)獗Wo(hù)下,升溫至120℃,攪拌下反應(yīng)8h后停止。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫,抽濾,所得濾液攪拌下倒入冰水中析出淺棕色固體,濾餅用乙醇索氏提取,直到提取液近乎無(wú)色為止。所得產(chǎn)品放置在紅外燈下干燥,碾碎得淺棕色粉末。產(chǎn)率:89%。

        1.3.2 N-鄰苯二甲酸酐殼聚糖的制備

        稱取5g殼聚糖和13.6g鄰苯二甲酸酐加入200mL單頸瓶中,再加入100mL DMF,升溫至130℃,攪拌條件下反應(yīng)8h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫,抽濾,所得濾液攪拌下倒入冰水中析出淺棕色固體,用乙醇洗滌兩次,所得產(chǎn)品放置在紅外燈下干燥,碾碎得淺棕色粉末。產(chǎn)率:92%。

        1.3.3 O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖的制備

        稱取1.5g鄰苯二甲酸酐保護(hù)的殼聚糖,8g MPEGI和0.8g Ag2O加入到500mL三口瓶中,充入氬氣,再加入90mL DMF,升溫至60℃,攪拌下條件下反應(yīng)16h后,再加入60mL水合肼和100mL蒸餾水,升溫至90℃后接著再反應(yīng)15h。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫,過(guò)濾,濾液濃縮,在濾液中加入硫酸鈉分液,取上層黃色油狀粗產(chǎn)物,裝入透析袋中透析4天,減壓濃縮,真空干燥,得淺色固體化合物。

        1.3.4 O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐殼聚糖的制備

        稱取1.2g制備的O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖加入100mL的三口瓶中,加入45mL DMSO充分溶解,然后加入0.9g馬來(lái)酸酐,繼續(xù)攪拌,升溫至60℃,反應(yīng)8h后停止。將裝置改為減壓蒸餾裝置,蒸出大部分的溶劑DMSO,然后加入10mL的蒸餾水,倒入透析袋中透析3天,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后再減壓抽干得0.7克白色固體。

        1.3.5 O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖的制備

        稱取0.5g已制備的mPEG-O-CS-N-MA溶于50mL蒸餾水中,然后加入250mL的三口瓶中,稱取4.8g的PEI溶于70mL蒸餾水中,倒入恒壓滴液漏斗中,升溫至60℃,攪拌下將PEI溶液滴入三口瓶中,反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后,用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋出大部分水后透析三天,然后旋干,再減壓抽干得0.8g白色固體。

        1.4 譜圖及譜圖分析

        從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出,殼聚糖的紅外吸收為:1599cm-1(酰胺II,-NH2伸縮振動(dòng))和1383cm-1(酰胺III)處為殼聚糖的特征吸收峰。羥基中O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰和N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰在3442cm-1處。C-H伸縮振動(dòng)吸收峰為2900cm-1和2873cm-1。1145cm-1為C-O-C彎曲振動(dòng)吸收峰,仲羥基中C-O伸縮振動(dòng)吸收峰為1093cm-1,1021cm-1為伯羥基中C-O伸縮振動(dòng)吸收峰為。

        合成后氨基被鄰苯二甲酸酐保護(hù)后,殼聚糖氨基的伸縮振動(dòng)吸收峰1599cm-1消失。同時(shí),在1712cm-1、1777cm-1處出現(xiàn)鄰苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰。而且,在720cm-1和795cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的搖擺振動(dòng)特征吸收峰,說(shuō)明氨基已經(jīng)被鄰苯二甲酸酐保護(hù)起來(lái)。

        在聚乙二醇化殼聚糖的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰1712cm-1、1777cm-1消失,說(shuō)明在水合肼中的作用下,鄰苯二甲?;淹耆幻撊?,氨基被釋放出來(lái)。并且2886cm-1和1114cm-1左右的吸收峰的強(qiáng)度明顯高于殼聚糖,這是由于接枝了mPEG后殼聚糖衍生物中亞甲基和醚鍵大量增加所致。

        由紅外譜圖中的數(shù)據(jù)可知,聚乙二醇化殼聚糖接枝馬來(lái)酸酐以后在1720cm-1出現(xiàn)了一吸收峰,這是接入馬來(lái)酸酐后形成特征吸收峰,表明了馬來(lái)酸酐成功接入殼聚糖。

        通過(guò)測(cè)試數(shù)據(jù)表明,馬來(lái)酸酐化殼聚糖與PEI發(fā)生邁克爾加成后,1720cm-1處吸收峰消失,說(shuō)明殼聚糖衍生物上的雙鍵與PEI的氨基發(fā)生反應(yīng)。并且接枝PEI后引入了大量的氨基,所以在1600cm-1左右出現(xiàn)了氨基的特征吸收峰。這就表明PEI已經(jīng)成功接枝到殼聚糖上形成預(yù)期的殼聚糖衍生物。

        結(jié)語(yǔ)

        為改進(jìn)殼聚糖在基因載體方面的應(yīng)用,提高殼聚糖的水溶性、穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和降低免疫源性,本課題合成了O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來(lái)酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖衍生物,。合成的最終產(chǎn)物,不僅提高殼聚糖的水溶性和穩(wěn)定性,提高轉(zhuǎn)染效率,而且由于引入大量的活性氨基,則便于殼聚糖的進(jìn)一步修飾。由紅外譜圖分析可知,6位羥基的mPEG和2位氨基的PEI已經(jīng)接上,得到了預(yù)期的產(chǎn)物。并且由于PEI的引入,引入了大量有反應(yīng)活性的氨基,如果要進(jìn)一步修飾衍生物,比如靶向性的引入半乳糖或者葉酸,則更加容易進(jìn)行。因此PEI的引入,為殼聚糖衍生物的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這種殼聚糖衍生物的水溶性很好,水溶性的改進(jìn)達(dá)到了預(yù)期的效果。而由于時(shí)間的限制,此衍生物在轉(zhuǎn)染方面的測(cè)試還沒(méi)來(lái)得及進(jìn)行,還有待繼續(xù)研究。

        參考文獻(xiàn)

        [1]馮小強(qiáng),楊聲,等.低殼聚糖降解制備、分離、純化、鑒別的研究進(jìn)展[J].高分子通報(bào),2006(10):82-89.

        [2]黃進(jìn),汪世龍,孫曉宇,等.殼聚糖及其衍生物基因載體的研究進(jìn)展[J].高分子通報(bào),2006(01):65-69.

        [3]鄭連英,等.殼聚糖的抗菌性能研究[J].材料科學(xué)與工程學(xué)報(bào),2000(10).

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