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        芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋

        2016-07-09 18:39:14武紅霞許文天羅純姚全勝王松標(biāo)馬小衛(wèi)詹儒林
        熱帶作物學(xué)報(bào) 2016年11期

        武紅霞 許文天 羅純 姚全勝 王松標(biāo) 馬小衛(wèi) 詹儒林

        摘 要 以紅芒6號(hào)為試材,對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育各時(shí)期果皮與果肉樣品提取RNA后等量混合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得了68 419 722個(gè)reads,包含6 157 744 980個(gè)核苷酸序列信息,平均讀長(zhǎng)90 bp,序列信息全部登陸NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(SRP035450)。對(duì)reads進(jìn)行拼接,共獲得124 002個(gè)Contig片段,進(jìn)一步組裝獲得54 207個(gè)Unigene片段,平均長(zhǎng)度為838 bp,閾值小于10-5的序列中共有42 515(78.43%)個(gè)unigenes被注釋到公共蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。其中,35 198個(gè)被注釋到生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分GO類別的44個(gè)功能組,14 619個(gè)Unigene匹配到25類COG功能組,23 741個(gè)Unigene被富集到128個(gè)KEGG代謝通路,包括代謝途徑、次生代謝的生物合成、植物-病原物互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、類黃酮類化合物合成等。本研究將為進(jìn)一步的芒果功能基因克隆、基因表達(dá)分析、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究奠定基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞 芒果;轉(zhuǎn)錄組;功能注釋

        中圖分類號(hào) S682.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

        芒果是著名的熱帶水果,素有“熱帶果王”之美譽(yù)。中國(guó)是主要的芒果生產(chǎn)國(guó)之一,2014年栽培面積14萬(wàn)hm2,產(chǎn)量130萬(wàn)t,主要分布在海南、廣西、云南、四川、廣東和福建等?。▍^(qū))。前期研究主要集中于栽培生理研究,如果實(shí)成熟過(guò)程[1-4]、果實(shí)香氣揮發(fā)物質(zhì)[5-6]、抗氧化活性[7-8]、采后處理和果實(shí)品質(zhì)研究[9-10],盡管芒果是中國(guó)熱區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)支柱,其基因組較小,但基因組信息相當(dāng)缺乏。近年來(lái),高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善為開(kāi)展不同生物功能基因組學(xué)研究提供了全新的思路和方法,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是基于下一代高通量測(cè)序技術(shù)建立的一種高效、快捷分子生物學(xué)研究手段,使科技工作者能在組學(xué)水平上研究基因組序列未知的非模式生物,從整體水平了解植物在特定階段的基因功能及基因結(jié)構(gòu),更加便利地提示特定生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制[11-13]。近年來(lái),已廣泛應(yīng)用于楊梅[14]、蘋果[15]、梨[16]、葡萄[17]、柑橘[18]等果樹(shù),芒果研究方面,Dautt-Castro等[19]用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究了與 Kent芒成熟過(guò)程相關(guān)的基因,在青熟和成熟果實(shí)中,2 306個(gè)基因差異表達(dá)。Luria 等[20]用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了熱水處理對(duì)芒果影響的分子機(jī)制,基于基因表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)鑒定了與熱處理相關(guān)基因,Azim等[21]報(bào)道了芒果葉綠體基因組,這些研究豐富了芒果生物信息數(shù)據(jù)。有關(guān)芒果果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組信息鮮有報(bào)道。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)illumina Hiseq 2 000對(duì)芒果發(fā)育成熟過(guò)程的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、拼接組裝,再用生物信息學(xué)的方法對(duì)得到的Unigene進(jìn)行注釋和功能分類,以期為芒果功能基因的發(fā)掘利用、特異miRNA的鑒定及功能分析等奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)于2012年3~7月在廣東省雷州市覃斗鎮(zhèn)芒果基地進(jìn)行,試驗(yàn)材料為15年生的紅芒6號(hào)芒果樹(shù),試驗(yàn)地土壤屬磚紅壤,株行距4 m×4 m,樹(shù)體生長(zhǎng)良好。分別于幼果期(花后50 d)、膨大期(花后80 d)、采收期(青熟)與成熟期(常溫放置后成熟)采集芒果果實(shí),每個(gè)時(shí)期采10~15個(gè)果,采集后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,將果皮與果肉分開(kāi)并用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

        1.2 方法

        1.2.1 芒果果皮與果肉RNA提取 RNA提取參照Shan等[22]建立的方法。

        1.2.2 芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的優(yōu)勢(shì),以紅芒6號(hào)芒果為材料,取不同發(fā)育階段的果皮與果肉樣本,分別提取總RNA后等量混合用于測(cè)序,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托深圳華大基因公司完成。提取的總RNA使用DNaseI消化DNA后,用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA;加入打斷試劑在Thermomixer中適溫將mRNA打斷成短片段,以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA,然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA,并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭,然后進(jìn)行片段大小選擇,最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增;構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2 100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后,使用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行測(cè)序。

        1.2.3 數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋 將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)去除接頭序列、或N含量過(guò)高或低質(zhì)量的序列,得到凈讀長(zhǎng),用Trinity軟件按Min contig length 100,Group pairs distance 250,path reinforcement distance 85,Min kmer cov 2參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)組裝。將具有重疊區(qū)域的reads連成更長(zhǎng)的Contig,采用Overlap的方法進(jìn)一步拼接成Unigene。

        通過(guò)Blastx程序?qū)nigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NR、Swiss-Prot、KEGG和COG(E值<0.00 001),并通過(guò)Blastn程序?qū)nigene與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)NT(E值<0.00 001)進(jìn)行比對(duì),獲得Unigene最高序列相似性的蛋白,便得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。將Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得Unigene可能的功能注釋及功能分類。根據(jù)nr注釋信息,利用Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息,并對(duì)所有Unigene用WEGO軟件進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì),根據(jù)KEGG注釋信息進(jìn)一步分析得到Unigene的Pathway途徑注釋。

        預(yù)測(cè)編碼蛋白框:按NR、Swiss-Prot、KEGG和COG順序?qū)nigene序列與以上數(shù)據(jù)庫(kù)Blastx比對(duì)(E值<10-5),取Blast比對(duì)結(jié)果中排列最高的蛋白確定該Unigene的編碼區(qū)序列,將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列,得到該基因編碼區(qū)的核苷酸序列(序列方向5′→3′)和氨基酸序列。若Unigene比對(duì)不上以上數(shù)據(jù)庫(kù),用軟件ESTScan[23]預(yù)測(cè)編碼區(qū),得到其編碼區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

        2.1.1 果實(shí)轉(zhuǎn)錄組組裝概要 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得82 817 950讀段,經(jīng)過(guò)去除雜質(zhì)和冗余處理,得到68 419 722條凈讀段,6.1Gb(6 157 744 980 bp)的有效數(shù)據(jù),13×的測(cè)序深度,平均讀長(zhǎng)90 bp。其中讀長(zhǎng)大于20個(gè)堿基比例為95.27%,GC%值為45.52%,可以看出此次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較好,可為后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝提供很好的原始數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝得到124 002個(gè)Contig,平均長(zhǎng)度為338 bp,N50值為623 bp。進(jìn)一步拼接得到54 207個(gè)Unigene,平均長(zhǎng)度838 bp,N50值為1 328。按序列相似度對(duì)Unigene進(jìn)行基因家族聚類,相似度大于70%的命為Clusters,共26 413個(gè),Singleton序列有27 794個(gè),其中E值小于10-5的序列共43 751個(gè)(表1)。54 207個(gè)Unigene的注釋信息見(jiàn)http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391914001523。

        2.1.2 Contig和Unigene序列長(zhǎng)度分布 組裝的124 002個(gè)Contig中,核苷酸長(zhǎng)度在100~200 bp的序列數(shù)有74 842,比例達(dá)到了60.36%;200~300 bp有17 520,占14.13%;300~400 bp有8 714,占7.03%;400~500 bp 的有4 538條,占3.66%;而≥ 500 nt的共有18 388條,比例為14.83%。由此可見(jiàn),Contig片斷長(zhǎng)度以100~200 bp為主(表2)。在Contig數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,采用over-lap進(jìn)一步拼接,共獲得了54 207個(gè)unigene片段,其中核苷酸長(zhǎng)度在100~500 bp的序列數(shù)有25 509,比例高達(dá)47.06%,500~1 000 bp有12 727,比例為23.48%;1 000~1 500 bp有7 312,占13.49%;1 500~2 000 bp有 4 334條,占8.01%;≥2 000 bp有4 315,占7.96%(表3)。

        2.1.3 Unigene的序列同源性分析 經(jīng)Blast比對(duì)無(wú)冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)NR后,對(duì)Unigene進(jìn)行分析,從比對(duì)的E值來(lái)看(圖1-A),發(fā)現(xiàn)29.68%的序列具有一定的同源性(10-30

        序列的相似性比較結(jié)果表明,相似性高于80%的序列高達(dá)27.8%,相似性在60%~80%的序列高達(dá)45.7%,而26.5%的序列相似性在18%~60%間(圖1-B)。對(duì)獲得的 Unigene進(jìn)行Blastn分析(圖1-C),大部分Unigene序列和葡萄、蓖麻、毛果楊、大豆、苜蓿、擬南芥的同源序列比對(duì)上。統(tǒng)計(jì)顯示29.9%的Unigene可比對(duì)到葡萄;27.6%的Unigene與蓖麻同源;依次為毛果楊(22.9%),大豆(6.3%),擬南芥(1.1%)等,這說(shuō)明芒果與葡萄的進(jìn)化關(guān)系較近。

        2.2 Unigene功能注釋

        通過(guò)Blastx程序在不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)(表4),42 515條unigene比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫(kù),26 380條Unigene比對(duì)到Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù),23 741條Unigene用于KEGG途徑分析,14 619條進(jìn)行COG分析,35 198條被用于GO分類。

        2.2.1 Unigene的GO功能分類分析 12 923條Unigene與GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性,且較多的單條Unigene與多種基因相對(duì)應(yīng),建立了302 479條對(duì)應(yīng)關(guān)系,從而得到盡可能多的注釋和分類。芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中的Unigene根據(jù)GO功能可分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類58分支(表5)。生物學(xué)過(guò)程類別中,細(xì)胞代謝過(guò)程和代謝過(guò)程涉及的基因最多,分別有23 131和22 003 條,細(xì)胞組分類別中,組成細(xì)胞和細(xì)胞部分涉及的基因最多,均為28 286條,分子功能類別中,結(jié)合功能涉及的基因最多,有17 458條,其次是具有催化活性功能的基因,達(dá)到了16 842條,其他種類基因的表達(dá)豐度不盡相同。

        2.2.2 Unigene的COG功能分類 將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),27 869條Unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性,且較多的單條Unigene能夠與多種基因相對(duì)應(yīng),建立了65 536條對(duì)應(yīng)關(guān)系(表6)。Unigene根據(jù)功能大致可分為25類,Unigene的COG功能種類比較全面,涉及了大多數(shù)的生命活動(dòng),其中整體功能類的基因數(shù)量最多,有4 774 條,其次是轉(zhuǎn)錄功能(2 596),復(fù)制、重組和修復(fù)功能(2 268),翻譯后加工、蛋白質(zhì)折疊的伴侶蛋白(2 098),碳水化合物運(yùn)輸和代謝(1 627),核結(jié)構(gòu)相關(guān)基因類的數(shù)量最少,只有4條,而未知功能的序列多達(dá)1 361條。COG分類結(jié)果表明這些Unigene涉及許多的生物學(xué)功能,這些未知基因可能參與芒果果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和成熟的調(diào)控。

        2.2.3 Unigene的KEGG代謝途徑分類 芒果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有23 741個(gè)Unigene能注釋到128類代謝途徑中(表7),包括代謝途徑、次生代謝的生物合成通路、植物-病原互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA剪切、RNA運(yùn)輸、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工、淀粉和蔗糖代謝、苯丙氨酸的生物合成、萜類化合物合成,脂類代謝,RNA降解、黃酮和黃酮醇的生物合成等,其中代謝途徑和次生代謝的生物合成所注釋的Unigene數(shù)最多,分別為4 969和2 450。

        2.3 編碼蛋白框(CDS)的核苷酸和氨基酸序列分析

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