肖小虎　隋金蕾　戚繼艷　陽江華　朱晉恒　唐朝榮

摘 要 以已發(fā)表的PPCK序列為探針，對橡膠樹和其他5種植物（木薯、水稻、楊樹、蓖麻和擬南芥）的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行全面搜索，鑒定得到17個PPCK基因，其中包括3個橡膠樹PPCK基因，命名為HbPPCK1-3。序列分析發(fā)現(xiàn)，HbPPCK1-3和其他植物一樣在結(jié)構(gòu)上非常保守，只有一個內(nèi)含子和一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，并且相對位置也比較一致。在進化上，橡膠樹、木薯和蓖麻3種大戟科植物的PPCK蛋白具有較近的親緣關(guān)系。HbPPCK3在樹皮中表達豐度最高，其次是種子和雄花；HbPPCK2在膠乳和根中表達豐度相對較高，而HbPPCK1在各組織中的表達都比較低。另外，大部分家族成員的表達都受到真菌侵染、低溫和干旱脅迫處理的誘導(dǎo)，而乙烯利處理卻能抑制HbPPCK2的表達。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；PPCK；基因家族；結(jié)構(gòu)和進化；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

在植物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）以Mg2+或Mn2+為輔助因子， 催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和HCO3-生成草酰乙酸（OAA）和無機磷酸的不可逆性反應(yīng)。PEPC廣泛存在于光合生物， 如植物、藻類、藍細菌和光合細菌中， 還存在于很多非光合細菌和原生動物中。PEPC催化的反應(yīng)為細胞各種組分的生物合成提供四碳二羧酸， 參與維持檸檬酸循環(huán)，在初級代謝中有重要的補給作用，在C4植物和CAM植物的光合作用中催化大氣中CO2固定的第一步反應(yīng)，是C4光合作用途徑中最重要的酶之一[1]。PEPC的活性主要是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶（phosphoenolpyruvate carboxylase kinases，PPCKs）來調(diào)節(jié)[2]。PPCKs是鈣調(diào)控型蛋白激酶的一員，但卻缺少鈣依賴型蛋白激酶所特有的自抑區(qū)（auto-inhibitory）和EF-hands結(jié)構(gòu)域，所以PPCK是一種非鈣依賴型蛋白激酶[2-3]。在景天酸代謝植物玉吊鐘（Kalanchoe fedtschenkoi）、C4植物玉米已有研究和C3植物擬南芥中已有相關(guān)研究[3-5]，研究認為PPCK的表達主要通過轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控。在橡膠樹中，橡膠的生產(chǎn)通過割膠來完成，割膠對橡膠樹來說是一種機械傷害，而作為一種傷害信號卻推動了橡膠的生物合成。人工使用乙烯利進行刺激可以顯著提高膠乳的產(chǎn)量，正是應(yīng)用了橡膠樹樹皮對激素刺激的應(yīng)答能力，進而使橡膠樹光合作用產(chǎn)物流向橡膠樹的生物合成[6-7]。本研究以已發(fā)表PPCK蛋白氨基酸序列為探針[3-5]，對橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻6種植物的全基因組數(shù)據(jù)進行全面搜索，鑒定得到17個PPCK基因家族成員，其中橡膠樹中有3個。筆者利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫，對橡膠樹PPCK基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、進化和表達水平進行了初步分析。研究結(jié)果將有助于筆者深入了解橡膠樹PPCK基因在橡膠樹生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室Solexa測序所用的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）熱研7-33-97材料，除了根來自于組培苗外，其他組織（包括膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花）均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊的正常割膠橡膠樹（開割2 a以上），根來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華玉偉老師贈送的熱研7-33-9組培苗；不同發(fā)育時期的橡膠樹葉片來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所種質(zhì)資源圃，為1年生的熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要來自于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊，品系為熱研7-33-9，正常開割樹（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同時間處理橡膠樹，相應(yīng)4個時間點分別為0、3、12、24 h，具體實驗參照相關(guān)文獻中的方法進行[8]。

網(wǎng)上測序數(shù)據(jù)來自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，包括不同組織（PRJNA201084），真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance， PRJNA179126，葉片）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078，葉片）和乙烯利處理（PRJNA182079，膠乳），詳細信息參見數(shù)據(jù)庫中相關(guān)說明（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析 為了全面鑒定橡膠樹、擬南芥、楊樹、水稻、木薯和蓖麻的PPCK基因家族成員，筆者從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫下載了6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。以已發(fā)表的PPCK序列為探針[3-5]，對6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行搜索，得到候選PPCK基因家族成員，利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對候選基因的結(jié)構(gòu)域進行分析。再利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）對基因的等電點和分子量進行分析。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)與進化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對橡膠樹和其他5種植物PPCK基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進行分析。利用MEGA 6.0軟件對橡膠樹和其他5種植物的PPCK氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining方法進行分子系統(tǒng)學(xué)分析，進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗。

1.2.3 基因的表達模式分析 利用本實驗室和NCBI的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對橡膠樹PPCK基因家族成員的表達模式進行分析[9]。首先，將NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中橡膠樹相關(guān)的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載到本地服務(wù)器，去除低質(zhì)量序列，利用程序RSEM進行表達分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPCK基因家族成員的鑒定與序列分析

利用tblastn搜索橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻6種植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到17個基因家族（表1），其中包括3個橡膠樹基因家族，命名為HbPPCK1-3。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹PPCK蛋白為276～278個氨基酸，分子量為31～32 ku，等電點在5.6～6.5之間，內(nèi)含子數(shù)目均為1。氨基酸序列多序列比對發(fā)現(xiàn)，橡膠樹PPCK蛋白都含有蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和進化分析

基因結(jié)構(gòu)和進化分析發(fā)現(xiàn)（圖2），6種植物基因家族成員在內(nèi)含子數(shù)目和相對位置，以及結(jié)構(gòu)域的相對位置上都非常一致，均僅有1個內(nèi)含子和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。在進化上，單子葉植物和雙子葉植物分別聚在一起，而雙子葉植物又分出2個分支，其中HbPPCK1位于一個分支，HbPPCK2和HbPPCK3位于一個分支。有部分物種存在同源蛋白對，如HbPPCK2和HbPPCK3、AtPPCK1和AtPPCK2、PtPPCK3和 PtPPCK4等，說明這些同源對具有較近的親緣關(guān)系。橡膠樹基因家族成員主要和木薯、蓖麻2種大戟科植物PPCK聚在一起，這3種植物具有較近的親緣關(guān)系一致。

2.3 橡膠樹PPCK基因家族成員的表達分析

利用本實驗室現(xiàn)有的Solexa測序數(shù)據(jù)對3個橡膠樹PPCK基因在不同組織、不同葉片發(fā)育時期和乙烯利處理下的表達模式進行分析。結(jié)果表明：HbPPCK3在樹皮中表達豐度最高，其次是種子和雄花；HbPPCK2主要在膠乳和根中表達，在其他組織中的表達偏低，隨乙烯利刺激時間加長，表達呈下降趨勢。HbPPCK1在所檢測的所有組織中表達都很低（圖3）。另外，各基因家族成員在葉片中的表達豐度相對其他組織都非常低，在葉片發(fā)育過程中也沒有明顯變化趨勢。

筆者還利用NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對橡膠樹PPCK的表達情況進行了分析。分析結(jié)果表明，HbPPCK3同樣在樹皮中表達豐度最高，C. cassiicola侵染、干旱、低溫和乙烯利刺激都會不同程度的誘導(dǎo)HbPPCK3表達；HbPPCK2主要在膠乳中表達，低溫處理后其表達豐度都會升高，而乙烯利刺激后表達豐度降低與本實驗室數(shù)據(jù)結(jié)果一致；HbPPCK1在各組織中表達都很低，C. cassiicola侵染和低溫處理會誘導(dǎo)其表達。

從以上兩部分實驗數(shù)據(jù)的結(jié)果來看，一個明顯的特征就是HbPPCK3在樹皮中高豐度表達，并且表達豐度要遠遠高于其他基因或其他組織，并且各種脅迫處理都會不同程度的誘導(dǎo)該基因的表達。這說明HbPPCK3可能在橡膠樹響應(yīng)逆境脅迫應(yīng)答方面具有重要功能。另外，NCBI和本實驗室數(shù)據(jù)結(jié)果的一致性，說明了本實驗分析結(jié)果的準確性。

3 討論

PEPC是C4光合作用途徑中最重要的酶之一，PPCK通過磷酸化調(diào)節(jié)PEPC活性。本研究充分利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源，從橡膠樹、木薯、水稻、楊樹、蓖麻和擬南芥6種植物的全基因組數(shù)據(jù)中鑒定出17個PPCK基因家族成員，并從基因結(jié)構(gòu)、進化和表達水平等方面進行了系統(tǒng)分析。在基因結(jié)構(gòu)方面，和CDPK-SnRK超家族的其他成員相比，PPCK較為簡單，僅有一個蛋白酶結(jié)構(gòu)域（圖2），除去激酶結(jié)構(gòu)域以外的編碼區(qū)很短。相對CDPK等其他CDPK-SnRK成員，PPCK缺少鈣依賴型蛋白激酶所特有的自抑區(qū)（auto-inhibitory）和EF-hands 結(jié)構(gòu)域，所以PPCK是一種非鈣依賴型蛋白激酶[2-3]。在進化方面，PPCK主要分為2個較大的分支，單子葉植物和雙子葉植物分別聚在一起，雙子葉植物又分出2個分支，其中HbPPCK2和 HbPPCK3位于一個分支，HbPPCK1位于一個分支，結(jié)合表達分析的結(jié)果可以看出，HbPPCK1在各組織中表達豐度都比較低，而HbPPCK2和HbPPCK3分別在不同組中高豐度表達，另外擬南芥的2個PPCK成員也和HbPPCK2、HbPPCK3位于同一分支，因而可以初步推測HbPPCK2和HbPPCK3所處的分支為PPCK進化的主要方向。已有研究認為，PPCK基因的表達主要通過轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控[3-5]，在本研究中HbPPCK1在各組織中表達豐度都比較低或不表達，HbPPCK2和HbPPCK3的表達具有一定的組織特異性，并且受不同脅迫處理的調(diào)控，如HbPPCK3主要在樹皮和種子中表達，真菌侵染、干旱、低溫和乙烯利刺激都會不同程度的誘導(dǎo)其表達，HbPPCK2主要在膠乳中表達，低溫處理可以誘導(dǎo)其在葉片中的表達，而乙烯利處理會降低其在膠乳中的表達，由此推測逆境條件能誘導(dǎo)PPCK基因的表達，進而對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性進行調(diào)節(jié)。本實驗室的高通量數(shù)據(jù)已成功應(yīng)用于橡膠樹基因組數(shù)據(jù)分析以及橡膠樹蔗糖合成酶基因家族相關(guān)分析，相關(guān)結(jié)果已發(fā)表在Nature Plants[11]和 Febs Journal[9]，這進一步證實了本文數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。本研究利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫，對橡膠樹和其他植物PPCK基因家族成員的結(jié)構(gòu)、進化和表達進行了初步分析，研究結(jié)果將為進一步研究PPCK基因在橡膠樹光合作用和逆境脅迫應(yīng)答等方面的功能奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

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