（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462000）

乙?；墙M蛋白共價(jià)修飾的一種方式。可逆的組蛋白乙?；揎棸l(fā)生在核心組蛋白N端的賴氨酸殘基上，分別由組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙?；?HDACs)催化完成。HAT提高乙酰化水平，相反的HDACs則降低乙酰化水平[1]。HDACs是一個(gè)大家族，在哺乳細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)18個(gè)成員，根據(jù)其與酵母蛋白同源性被分為四類[2]。Ⅰ類HDACs包括HDAC1-3和HDAC8，與酵母蛋白R(shí)pd3同源,主要存在于細(xì)胞核中，在各種組織細(xì)胞中都有表達(dá)[3]。Ⅱ類HDACs包括HDAC4-7,HDAC9和HDAC10,與酵母蛋白Hda1同源，穿梭于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間，只在部分組織中有表達(dá)[4]。Ⅲ類HDACs與酵母蛋白Sir2同源，被稱作Sirtuins。成員有7個(gè)：SIRTl-SIRT7[5],在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都存在。HDAC11是Ⅳ類HDAC的唯一成員[6]。Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDAC被稱作經(jīng)典HDACs，經(jīng)典HDACs和Sirtuins催化機(jī)制不同：經(jīng)典HDACs為鋅離子依賴性蛋白[7]，Sirtuins為尼克酰胺腺苷酸（NAD）依賴性蛋白[8]。除了組蛋白外HDACs也能作用于非組蛋白，比如轉(zhuǎn)錄因子[9]，從而間接影響這些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的基因的表達(dá)，因此HDACs在調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程中扮演了重要角色。相關(guān)研究表明，HDACs與癌癥的發(fā)生有關(guān)[10]。目前，伏立諾他等HDAC抑制劑（HDACi）作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床并表現(xiàn)出了良好的治療效果，但是現(xiàn)在大部分的HDACi為廣譜型抑制劑,廣譜HDACi可能會(huì)引起多種副作用，比如凝血障礙、心律失常等[11]，這主要是因?yàn)镠DACs存在多種亞型，因此針對(duì)亞型選擇性的HDACi已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的一個(gè)熱點(diǎn)。HDAC11是HDAC家族發(fā)現(xiàn)最晚的一個(gè)成員，也是研究最少的一個(gè)成員，本文通過(guò)克隆表達(dá)HDAC11并對(duì)HDAC11的序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析希望對(duì)以后HDAC11的研究工作提供幫助。

一、材料與方法

1.材料

HDAC11序列（登錄號(hào)：NM_024827.3）和引物交由生工生物合成，載體pGEX-6P-1為實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌菌株DH（5α）和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物公司。EcoRⅠ,BamHⅠ和T4連接酶購(gòu)自fermentas,DNA marker和Protein Marker購(gòu)自全式金，質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自萊科百奧。

2.方法

2.1 hdac11 基因的擴(kuò)增

利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物。引物為正向-CG GGATCC ATGCTACACACAACCCAGCTGT ACC， 反 向 -CG GAATTC TCAGGGCACTGCAGGGGGAA，引物交由生工生物合成。以合成的HDAC11序列為模版進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，參數(shù)為：94℃預(yù)變性10min;94℃ 30s,60℃ 30s,72℃1.5min,30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將回收的目的片段與pGEX-6P-1載體分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，并將酶切產(chǎn)物按一定比例16℃連接5h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH（5α）感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆做雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定。

2.3 重組蛋白的表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，OD600=0.6時(shí),加入IPTG使其終濃度為0.1 mM/L,16℃誘導(dǎo)表達(dá)12h，離心收集菌體。用PBS重懸菌體沉淀，超聲破碎后高速離心，取上清和沉淀制樣跑膠分析目的蛋白的表達(dá)形式。

2.4 HDAC11的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam和Protscale對(duì)HDAC11的氨基酸序列及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，blast在線分析HDAC11的同源性，SOPMA對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，NetPhos和SUMOplot對(duì)其進(jìn)行翻譯后修飾預(yù)測(cè)。

二、結(jié)果與分析

1.目的蛋白的克隆表達(dá)

1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ做雙酶切鑒定，獲得4900bp的載體片段和約1000bp的目的基因片段，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

1.2 重組蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體,SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,加入IPTG誘導(dǎo)后,轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株總蛋白提取物中出現(xiàn)一條分子量約為65kD的蛋白條帶,與重組HDAC11蛋白大小相符,表明重組表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白得到表達(dá)。但HDAC11蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析

2.HDAC11的生物信息學(xué)分析

2.1 HDAC11的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析

ProtParam分析表明HDAC11(UniProtKB：Q96DB2)共含有347個(gè)氨基酸殘基，含量較高的是亮氨酸（10.1%）、甘氨酸（8.4%）、纈氨酸（7.8%）和精氨酸（7.8%），含量較少的氨基酸有半胱氨酸（0.6%）、色氨酸（1.4%）等。將人 HDAC11 的氨基酸序列與小鼠（UniProtKB/Swiss-Prot：Q91WA3.1），食蟹猴（UniProtKB/Swiss-Prot：Q9GKU5.2）的 HDAC11 序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)同源性均達(dá)到90%以上。將人源HDAC11與人源HDAC1-HDAC10蛋白進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明HDAC11與其他HDAC蛋白的同源性均不高，其與HDAC1具有31%的最高同源性，與HDAC5的同源性最低，為21%。HDAC11的分子式為C1763H2786N490O501S10，分子量為39183，酸性氨基酸有44個(gè)，堿性氨基酸有44個(gè)，理論等電點(diǎn)7.17為中性蛋白。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為39.1，根據(jù)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)推測(cè)該蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為96.05。

2.2 HDAC11的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 HDAC11的氨基酸組成分析

利用SOPMA在線軟件對(duì)HDAC11蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例最高，達(dá)到37.75%，無(wú)規(guī)卷曲次之，為30.26%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比例分別為19.88%和12.10%。因此α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲是該蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。含量最高的α-螺旋主要分布于氨基酸殘基的43-66、76-92、154-170、232-247四個(gè)區(qū)域，無(wú)規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則不均勻地分布于整個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈中。

圖4 HDAC11的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.3 HDAC11的翻譯后修飾預(yù)測(cè)

利用NetPhos對(duì)HDAC11蛋白進(jìn)行磷酸化修飾預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白擁有9個(gè)絲氨酸，2個(gè)蘇氨酸和1個(gè)酪氨酸共12個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。利用SUMOplot對(duì)其進(jìn)行SUMO化修飾預(yù)測(cè)，結(jié)果表明HDAC11有兩個(gè)評(píng)分較高的修飾位點(diǎn)，分別為K280和K50。

圖5 HDAC11的磷酸化位點(diǎn)分析

圖6 HDAC11的SUMO化位點(diǎn)分析

三、討論

本研究將hdac11基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，目的蛋白有表達(dá)，但是以包涵體的形式存在。外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致形成無(wú)活性的包涵體，目前減少包涵體形成主要有兩種策略：①降低蛋白合成速度比如降低誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度[12]；②加入促進(jìn)可溶性表達(dá)的生長(zhǎng)添加劑[13]。對(duì)于已經(jīng)形成包涵體的蛋白可通過(guò)將包涵體蛋白體外復(fù)性得到生物活性蛋白。另外本文利用生物信息學(xué)軟件如ProtParam、ProtScale、SOPMA等對(duì)HDAC11的序列，理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)。對(duì)HDAC11的氨基酸和理化性質(zhì)分析可知，HDAC11在人、小鼠和食蟹猴中的序列非常保守，而HDAC11與其他家族成員的同源性非常低，相比較而言HDAC11更接近于Ⅰ類HDACs。對(duì)HDAC11的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋的比例較高，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比較松散并隨環(huán)境而改變，常構(gòu)成酶活性部位和蛋白質(zhì)特異的功能部位。另外HDAC11可能存在12個(gè)磷酸化位點(diǎn)，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道HDAC1-HDAC10的10個(gè)蛋白均含有磷酸化位點(diǎn)，比如HDAC1 的 S421[14]、HDAC6 的 S1035[15]、HDAC7 的 T286[16]、HDAC8 的 S39[17]等，這些修飾可能會(huì)影響酶的活性或蛋白的定位。Ⅱa類HDACs在細(xì)胞內(nèi)的定位主要是由核的輸入輸出信號(hào)和14-3-3蛋白調(diào)控，HDAC4、5、7、9含有三個(gè)保守的14-3-3結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合14-3-3后會(huì)以一種磷酸化依賴的方式將HDACs留在細(xì)胞質(zhì)中[17]。比如HDAC4的S350被磷酸化后與14-3-3的結(jié)合力增強(qiáng)[18]，HDAC5的S259和S498被磷酸化后會(huì)促進(jìn)蛋白從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)[19]，因此對(duì)于Ⅱa類HDACs來(lái)說(shuō)磷酸化影響了蛋白的定位。HDAC1的S421和S423被磷酸化后會(huì)促進(jìn)酶活性及與NuRD及SIN3復(fù)合物的相互作用[14]，而HDAC8的S39被磷酸化后會(huì)降低酶活性[17]，對(duì)于HDAC11來(lái)說(shuō)，磷酸化可能影響了它的酶活性。另外HDAC11還含有潛在的SUMO化修飾位點(diǎn)，對(duì)于HDACs家族而言，已有文獻(xiàn)報(bào)道HDAC1、3、4、6和 9有 SUMO化修飾[20,21]，HDAC1的 K444和 K476被修飾后酶的活性增強(qiáng)[21]，SUMO化可能也影響了HDAC11的活性。

四、結(jié)論

本研究一方面將該基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中進(jìn)行目的蛋白表達(dá),結(jié)果以包涵體形式表達(dá),另一方面利用生物信息學(xué)軟件分析了該蛋白的氨基酸序列、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)等，為進(jìn)一步了解該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之間的差異打下基礎(chǔ)。

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