鄭素明　關(guān)俊輝（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院　廣東廣州5040；廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院　廣州5030）

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膝骨關(guān)節(jié)炎不同證型軟骨細(xì)胞在t-RNA中的表達(dá)*

鄭素明1關(guān)俊輝2
（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院廣東廣州510240；2廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院廣州510130）

摘要：目的：研究膝骨關(guān)節(jié)炎不同證型軟骨細(xì)胞在t-RNA中的表達(dá)情況。方法：選取股骨頭壞死患者30例，按照脾腎兩虛型以及肝腎虧虛型進(jìn)行辨證分型和分組（各15例）。以實驗室培養(yǎng)不同證型的軟骨細(xì)胞作為研究方法，并對不同證型軟骨細(xì)胞中t-RNA的表現(xiàn)形式進(jìn)行觀察，通過染色觀察后，對軟骨組織的表達(dá)形式進(jìn)行研究分析。結(jié)果：肝腎虧虛型組中MMP-1/-13RNA在目標(biāo)基因的表達(dá)方面均明顯低于脾腎兩虛型組，這表明在基因表達(dá)方面兩種證型之間存在明顯的差異。軟骨組織細(xì)胞的外在形態(tài)由t-RNA的轉(zhuǎn)錄情況決定，在遞變性的不同證型研究中，軟骨組織的退化主要的原因取決于軟骨組織中t-RNA的轉(zhuǎn)錄效果。結(jié)論：治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，并改善患者的生活質(zhì)量，應(yīng)當(dāng)從神經(jīng)遞質(zhì)以及細(xì)胞增生激素來進(jìn)行局部控制，并以此來抑制或者促進(jìn)t-RNA的轉(zhuǎn)錄，只有如此才能夠有效地控制關(guān)節(jié)組織的退化進(jìn)度。在改善人體的基本環(huán)境后，對人體的組織成長基本情況會有優(yōu)化作用。在現(xiàn)代臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療中，應(yīng)當(dāng)從人體軟骨組織入手，并以此來作為研究的根本，從細(xì)胞核中m-RNA和t-RNA的轉(zhuǎn)錄作為研究的根本進(jìn)行臨床試驗的研究分析，必然可以在臨床檢驗研究中得出更直接的證據(jù)。

關(guān)鍵詞：膝骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；t-RNA；基因表達(dá)

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）屬于一種慢性炎癥性骨科疾病，致病機(jī)理較多，其中包括了工作環(huán)境、遺傳以及體內(nèi)抗原特性，對人體的日常生活會產(chǎn)生較大的影響[1]。KOA的主要并發(fā)癥狀就有關(guān)節(jié)腫脹、壓痛等，并出現(xiàn)伴隨性關(guān)節(jié)疼痛，且軟骨組織細(xì)胞會逐漸退化，進(jìn)而引起人體的骨質(zhì)畸形[2]。在對其進(jìn)行研究的過程中，以核糖核酸的轉(zhuǎn)錄表達(dá)形式進(jìn)行分析研究?，F(xiàn)報告如下：

1　資料和方法

1.1一般資料選擇我院2013年6月～2014年6月就診治療的中老年膝關(guān)節(jié)炎患者30例的軟骨組織標(biāo)本，符合WHO對膝關(guān)節(jié)炎患者的納入標(biāo)準(zhǔn)，按照脾腎兩虛型以及肝腎虧虛型進(jìn)行辨證分型和分組（各15例）。年齡45～70歲，平均（51.6±7.2）歲，術(shù)前未接受任何藥物治療，并簽署了治療知情同意書。排除創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他性質(zhì)的關(guān)節(jié)炎，及嚴(yán)重器官疾病患者。對患者的軟骨組織進(jìn)行選取后，可進(jìn)行分析。

1.2主要試劑及儀器實驗試劑：Trizol（日本Takara公司），RT-PCR試劑（德國DBI公司），DEPC（美國Sigma公司），RNasin（美國Promega公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國DBI公司）。實驗儀器：SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司），UV-1206分光光度計（日本SHIMODZU公司），SCR20B冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司），Z323K臺式低溫高速離心機(jī)（德國HERMLE公司），TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Mini-6K水平離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），GDS7600水平式電泳儀（北京東方儀器廠），DF-23B凝膠掃描系統(tǒng)（英國UVP公司），BS210S電子天平（日本Satorius公司），－80℃超低溫保存箱（海爾集團(tuán)），ABI9700PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司），Real time PCR儀（美國Agilent公司）。

1.3實驗方法

1.3.1Real time PCR檢測MMP1、MMP13 mRNA的表達(dá)變化取適量組織，在液氮中充分研磨，加入1 ml Trizol，震蕩混勻室溫放置5 min；加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，靜置3 min；4℃12 000 rpm離心10 min，把上層水相轉(zhuǎn)移到新的管中；加入等體積異丙醇，混勻，靜置20 min；4℃12 000 rpm離心10 min，去上清；用1 ml 75%DEPC酒精洗滌沉淀；4℃12 000 rpm離心5 min，棄去液體；室溫晾干后，加入30 μl DEPC處理過的ddH2O水，溶解RNA，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2去基因組使用RNase-free的DNase·I （Promega），按RNA 20 μl，DNaseⅠ20 μl，10 x buffer 10 μl，RNase inhibitor 0.5 μl，H2O（RNase free）49.5 μl配置反應(yīng)液100 μl，37℃消化30 min，65℃滅活10 min。然后加入等體積的苯酚，上下顛倒混勻后10 000 rpm離心5 min，取上清；加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻后10 000 rpm離心10 min，取上清；加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，－20℃靜置15 min；4℃下，10 000 g離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗滌兩次，超凈臺風(fēng)干；加入15～40 μl DEPC水溶解沉淀。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄以2 μg總RNA為模板，按照Bestar qPCR RT Kit說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體系為20 μl，合成cDNA第一鏈。首先按照RNA2.0 μg，DEPC H2O配制反應(yīng)液10 μl；然后65℃，5 min，冰上急冷；再按上述反應(yīng)液10 μl，5xRT Buffer RT 4 μl，Enzyme Mix 1 μl，Primer Mix 1 μl，DEPC H2O 4 μl配制反應(yīng)液20 μl；37℃，60 min；98℃，10 min，合成cDNA第一鏈，并收集備用。

1.3.4PCR檢測Real time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μl（DBI Bestar SybrGreen qPCRmasterMix），反應(yīng)體系按照Bestar SybrGreen qPCRmasterMix 10 μl，PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 8 μl模板配制20 μl；PCR反應(yīng)條件：94℃2 min，94℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，40循環(huán)。融解曲線分析：溫度62～95℃。每個樣本重復(fù)3次，用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進(jìn)行熒光定量PCR實驗。

1.4數(shù)據(jù)處理實驗按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。其中，△Ct=（目的基因Ct-內(nèi)參Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（若無參照樣品則選擇Ct最大的樣品為參照進(jìn)行計算）。

2　結(jié)果

2.1兩組rt-PCR中MMP1的△Ct值比較兩組情況比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果判定當(dāng)P=0.018＜0.05認(rèn)為方差不齊。選用Wilcoxon秩和檢驗：Wilcoxon w=1035.00，Z=-8.171，P＜0.001，故差異明顯。

表1　兩組rt-PCR中MMP1的△Ct值及組間比較（±s）

表1　兩組rt-PCR中MMP1的△Ct值及組間比較（±s）

組別　n　rt-PCR中MMP1的△Ct值肝腎虧虛型脾腎兩虛型15 15 3.2993±0.42186 1.2038±0.57784

2.2兩組rt-PCR中MMP13的△Ct值比較兩組情況比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果判定當(dāng)P=0.01＜0.05認(rèn)為方差不齊。選用Wilcoxon秩和檢驗：Wilcoxon w=1035.00，Z=－8.171，P＜0.001，故差異明顯。

表2　兩組rt-PCR中MMP13的△Ct值及組間比較（±s）

表2　兩組rt-PCR中MMP13的△Ct值及組間比較（±s）

組別　n　rt-PCR中MMP13的△Ct值肝腎虧虛型脾腎兩虛型15 15 3.9147±1.14625 1.2911±0.48166

根據(jù)本實驗研究，在實時PCR（real time PCR）檢測組間△Ct值的差異存在明顯異常，Ct值指的就是擴(kuò)增曲線達(dá)到閾值時的循環(huán)圈數(shù)，而對于循環(huán)圈數(shù)而言，次數(shù)越大表明該基因的表達(dá)程度越低。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計，肝腎虧虛型組中MMP-1/-13RNA在目標(biāo)基因的表達(dá)方面均明顯小于脾腎兩虛型組。對軟骨組織細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果中的表現(xiàn)現(xiàn)象研究，在培養(yǎng)了24 h左右期間的組織細(xì)胞中，可清晰地看到核仁，其中部分軟骨組織細(xì)胞出現(xiàn)群集生長，而初代軟骨組織在培養(yǎng)到5 d后，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形態(tài)，并排列緊密。對于不同證型軟骨組織細(xì)胞m-RNA表達(dá)水平的分析中，從外源性的濃度分析，可得出t-RNA細(xì)胞的表現(xiàn)形式，經(jīng)對比后，外源性濃度出現(xiàn)增加趨勢，和細(xì)胞內(nèi)t-RNA的表達(dá)有著直接關(guān)系。如果在臨床治療中，能夠有效的抑制t-RNA表達(dá)，則可以有效的抑制KOA導(dǎo)致的軟骨組織退化。

3　討論

KOA屬于常見的軟骨組織退化導(dǎo)致的疾病，此處的組織細(xì)胞自身并沒有充足的血液供給，并無神經(jīng)分布，而作為承重的主要組織材料，在承受沖擊力的同時，是保護(hù)人體的最主要構(gòu)成組織[3～4]。在進(jìn)行形態(tài)的表達(dá)中，組織細(xì)胞通過自身細(xì)胞中的基因表達(dá)來完成細(xì)胞分化，并以此來促進(jìn)機(jī)體的成長。但是伴隨著年齡的增長，人體各機(jī)能的退化，都會直接地影響到自身機(jī)體的各項組織表達(dá)形式。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，MMP-1、MMP-13參與了KOA的發(fā)病，在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用[5～6]。

MMP家族（MMPs）廣泛存在于各種結(jié)締組織中，是一類Zn2+、Ca2+依賴的重要蛋白水解酶家族，在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的生理和病理降解過程中起重要作用，可有效降解軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)，它的異常增高可能是導(dǎo)致ECM合成與降解失衡的重要原因。其中MMP-1和MMP-13具有強(qiáng)烈降解Coll-Ⅱ和蛋白多糖的作用。MMP-1主要由成纖維細(xì)胞分泌，可切割Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ、Ⅹ型膠原及明膠。MMP-1的活性增強(qiáng)對于軟骨基質(zhì)的降解起著關(guān)鍵性的作用；MMP-13可對各種膠原進(jìn)行有效降解，其降解Ⅱ型膠原纖維的能力是其他膠原酶的10～30倍，而且其他許多MMPs亞型對Ⅱ型膠原的降解需要通過MMP-13起作用。MMP-13是已知最有效的Ⅱ型膠原降解酶，可分解膠原三螺旋結(jié)構(gòu)[7]。

KOA是在人體老化過程中所表現(xiàn)出來的一種常見骨質(zhì)病癥。在對這一類患者進(jìn)行治療的過程中，通過注射刺激性藥物，以及消炎性藥物來抑制關(guān)節(jié)炎癥的并發(fā)，很難從根本上緩解患者的機(jī)體病狀，僅僅是在生活質(zhì)量上得到了一定的改善。在本次的臨床調(diào)研研究中，我們發(fā)現(xiàn)肝腎虧虛型組中MMP-1/-13RNA在目標(biāo)基因的表達(dá)方面均明顯小于脾腎兩虛組。這表明在基因表達(dá)方面兩種證型之間存在明顯的差異。通過分析不同證型軟骨組織細(xì)胞在t-RNA中的表達(dá)效果，了解到對于軟骨組織細(xì)胞分化的表達(dá)，需要通過相關(guān)RNA的有機(jī)結(jié)合，才能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化。在此階段中，抑制軟骨組織分化的細(xì)胞基液，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究分析，并以此來促進(jìn)現(xiàn)代臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效。由于機(jī)體促進(jìn)t-RNA表達(dá)的酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致分化的細(xì)胞因子減少，導(dǎo)致了膝關(guān)節(jié)內(nèi)骨贅的產(chǎn)生，從而引發(fā)軟骨組織退化。這一機(jī)理，對研究膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療研究方法，有著舉足輕重的效用，因此在今后的研究中，應(yīng)當(dāng)以此作為主要的研究方向進(jìn)行研究。

綜上所述，治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，并改善患者的生活質(zhì)量，應(yīng)當(dāng)從神經(jīng)遞質(zhì)以及細(xì)胞增生激素來進(jìn)行局部控制，并以此來抑制或者促進(jìn)t-RNA的轉(zhuǎn)錄，只有如此才能夠有效地控制關(guān)節(jié)組織的退化進(jìn)度。在改善人體的基本環(huán)境后，對人體的組織成長基本情況，會有優(yōu)化作用。在現(xiàn)代臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎中，應(yīng)當(dāng)從人體軟骨組織入手，并以此來作為研究的根本，從細(xì)胞核中m-RNA和t-RNA的轉(zhuǎn)錄作為研究的根本進(jìn)行臨床試驗的研究分析，必然可以在臨床檢驗研究中得出更直接的證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號：R684.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.02.013

*基金項目：廣東省科技計劃項目（編號：2011B031800330）

收稿日期：（2015-10-17）