侯慧，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物工程系，北京 100081）

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生物制造過(guò)程中的微生物生長(zhǎng)與調(diào)控

侯慧，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物工程系，北京 100081）

摘要：提高生物基產(chǎn)品的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率是生物制造發(fā)展的目標(biāo)。由于微生物具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單和基因操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，常用作生物基產(chǎn)品制造過(guò)程中的底盤(pán)宿主，因此，產(chǎn)品制造過(guò)程中微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)與調(diào)控尤為重要，其生長(zhǎng)調(diào)控會(huì)直接或間接地影響生物基產(chǎn)品的合成效率。微生物的生長(zhǎng)不僅受外界環(huán)境如溫度、溶氧量、pH等的影響，而且還受微生物本身的生長(zhǎng)與調(diào)控機(jī)制如細(xì)胞分裂調(diào)控、必需基因表達(dá)調(diào)控、程序化死亡等的影響。本文綜述了利用分子生物學(xué)、合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等方法對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂過(guò)程進(jìn)行分子調(diào)控，以提高生物反應(yīng)速率和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，為化工、食品、生物醫(yī)藥以及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域構(gòu)建高效的生物制造工藝提供新思路。

關(guān)鍵詞：生物制造；細(xì)胞生長(zhǎng)；分裂調(diào)控；必需基因；程序化死亡；生物產(chǎn)業(yè)

第一作者：侯慧（1989—），女，碩士研究生。E-mail 39houhui@sina.com。

聯(lián)系人：李春，教授，研究方向?yàn)樯锎呋?、酶工程、生物反?yīng)、生物能源。E-mail lichun@bit.edu.cn。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，生命科學(xué)和生物制造技術(shù)取得突破性進(jìn)展，生物基產(chǎn)品的生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步，產(chǎn)品質(zhì)量不斷提高，生物制造產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。生物制造是生物技術(shù)與工業(yè)制造技術(shù)相融合交叉形成的一個(gè)新興制造領(lǐng)域，將現(xiàn)代生物技術(shù)和生命科學(xué)應(yīng)用于生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)社會(huì)相關(guān)領(lǐng)域，為社會(huì)提供商品和服務(wù)，主要包括生物基化學(xué)品、生物醫(yī)藥、生物能源和食品等。我國(guó)已建成與生物制造研發(fā)相關(guān)的20家國(guó)家工程研究中心、15家國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室和40家國(guó)家級(jí)企業(yè)技術(shù)中心，并逐漸形成一定規(guī)模的生物制造體系。我國(guó)科研人員在微生物基因組工程技術(shù)、代謝工程技術(shù)、合成生物技術(shù)等方面不斷取得創(chuàng)新突破，一批大宗發(fā)酵產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力實(shí)現(xiàn)了大幅提升，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)與環(huán)境效益，多種生物產(chǎn)品的生產(chǎn)技術(shù)達(dá)到了國(guó)際領(lǐng)先水平，生物制造的發(fā)展正在為世界經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)注入新的活力，加速了生物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程，預(yù)計(jì)到2025年，全球生物基產(chǎn)品的產(chǎn)值將超過(guò)5000億美元[1-3]。

但是在生物制造發(fā)展過(guò)程中，還有許多關(guān)鍵問(wèn)題和技術(shù)難點(diǎn)沒(méi)有得到很好的解決，有待于進(jìn)一步去探討。生物制造過(guò)程涉及動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)與調(diào)控，其中90%以上利用微生物代謝用于生產(chǎn)。微生物生長(zhǎng)快、種類多、特性廣，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了完整的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)[4]，為生物制造的發(fā)展提供了基礎(chǔ)材料和豐富的基因資源。另外，微生物基因組較小、簡(jiǎn)單易操作，以微生物代謝為基礎(chǔ)的生物制造可以巧妙地通過(guò)基因組的設(shè)計(jì)、改造和再設(shè)計(jì)來(lái)創(chuàng)造新的工藝和合成更多的產(chǎn)品，為生物制造過(guò)程開(kāi)辟了新天地。由于微生物的生長(zhǎng)調(diào)控與高效生物制造密切相關(guān)，是生物制造過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，因此，通過(guò)調(diào)控微生物生長(zhǎng)可以直接、高效地提高其代謝過(guò)程中酶的活性和物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)而提高生物制造過(guò)程中產(chǎn)品的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。然而，微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)不僅受外界環(huán)境如溫度、溶氧量、pH等的影響，而且還受微生物本身的生長(zhǎng)與調(diào)控機(jī)制如細(xì)胞分裂調(diào)控、必需基因表達(dá)調(diào)控、程序化死亡等的影響，本文將從微生物細(xì)胞生長(zhǎng)與調(diào)控的分子機(jī)制來(lái)綜述如何調(diào)節(jié)和提升生物制造水平。

1　產(chǎn)物合成與微生物生長(zhǎng)

表1 生物制造產(chǎn)品舉例

隨著當(dāng)代生物科學(xué)特別是生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科技術(shù)與理論的成熟，人們對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、多糖、生物膜等大分子的研究已經(jīng)達(dá)到新的廣度和深度，如果將上述成果應(yīng)用到工程制造領(lǐng)域，那么人們將進(jìn)入一個(gè)全新的生物技術(shù)時(shí)代——生物制造。生物制造產(chǎn)品舉例見(jiàn)表1。生物制造應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模物質(zhì)加工與轉(zhuǎn)化，以微生物細(xì)胞或酶蛋白為催化劑進(jìn)行化學(xué)品合成，并應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、材料、能源和環(huán)保等領(lǐng)域。近年來(lái)，全球生物材料和化學(xué)品迅猛發(fā)展，生物基產(chǎn)品合成的基礎(chǔ)研究已經(jīng)具良好的基礎(chǔ)，關(guān)鍵技術(shù)已經(jīng)初步形成，DNA測(cè)序和快速合成、蛋白組學(xué)技術(shù)尤其是合成生物學(xué)的發(fā)展加快了生物制造的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，特殊微生物、酶的開(kāi)發(fā)使得生物資源的利用趨于多樣化、智能化和集成化，越來(lái)越多的大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品正在逐步向生物基產(chǎn)品的生產(chǎn)模式過(guò)渡，生物制造的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展格局趨于形成。1,3-丙二醇、3-羥基丙酸、丁二酸、類異戊二烯、1,4-丁二醇、異戊醇、丙烯酸等傳統(tǒng)化工產(chǎn)品的生物制造路線已經(jīng)建立，生化纖維及生物塑料等產(chǎn)品已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，生物制造以其原料來(lái)源廣泛、可再生、加工方式清潔、高效并且環(huán)境友好的優(yōu)勢(shì)，將成為傳統(tǒng)化工產(chǎn)業(yè)的有益的補(bǔ)充和完善。

生物制造過(guò)程控制在生產(chǎn)中發(fā)揮著掌控全局的作用，并且對(duì)微生物代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性、中間產(chǎn)物合成、代謝流的平衡和產(chǎn)品合成效率等有重要影響，因此，科學(xué)可行的過(guò)程控制措施是生物制造的重要內(nèi)容之一。生物制造的過(guò)程控制包括環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、溶氧量和營(yíng)養(yǎng)等以及細(xì)胞內(nèi)部的代謝參數(shù)如關(guān)鍵酶的改造、代謝途徑的重構(gòu)與優(yōu)化、細(xì)胞生長(zhǎng)與調(diào)控等，其中微生物細(xì)胞生長(zhǎng)與調(diào)控是主要的影響因素，是微生物代謝變化的反映和單細(xì)胞生產(chǎn)能力的衡量標(biāo)志，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率有顯著影響。因此，在生物制造過(guò)程中微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的可控調(diào)節(jié)是生物制造過(guò)程控制的關(guān)鍵，通過(guò)調(diào)控微生物細(xì)胞生長(zhǎng)地快慢來(lái)有效控制生物制造過(guò)程，以達(dá)到提高生物反應(yīng)速率和目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。細(xì)胞分裂是一切生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的基礎(chǔ)，與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)；必需基因是微生物不可或缺的基因，其突變或丟失通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；微生物程序化死亡是維持其種群延續(xù)的一種方式。因此，在對(duì)微生物本身的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)、合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等方法對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，靈活地調(diào)控微生物細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和死亡，以提高反應(yīng)速率和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量在生物制造領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

2　微生物細(xì)胞的分裂調(diào)控與產(chǎn)物合成

細(xì)胞分裂是一個(gè)細(xì)胞分裂為兩個(gè)細(xì)胞的過(guò)程，是一切生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的基礎(chǔ)，它保證遺傳物質(zhì)在前后代細(xì)胞中的連續(xù)性和穩(wěn)定性。大多數(shù)細(xì)菌、古細(xì)菌和單細(xì)胞真菌以二分裂方式進(jìn)行分裂，圖1為細(xì)菌二分裂過(guò)程的一個(gè)周期[5]。細(xì)胞分裂過(guò)程中的功能蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是這些蛋白的相互作用關(guān)系和精確控制細(xì)胞分裂的機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

圖1 細(xì)菌細(xì)胞分裂周期[5]

在原核生物細(xì)胞分裂中起核心作用的是FtsZ蛋白，它由383個(gè)氨基酸組成，是細(xì)胞分裂的起始蛋白，并且發(fā)揮著細(xì)胞骨架的核心作用[6]。細(xì)胞正常分裂時(shí)，GTP能夠誘導(dǎo)FtsZ蛋白聚合，在細(xì)胞中部聚集形成Z環(huán)狀骨架，隨后FtsZ招募其他十多種膜結(jié)合蛋白在細(xì)胞中部組裝成環(huán)狀復(fù)合物，使一個(gè)細(xì)胞壓縮分裂成兩個(gè)子細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞分裂順利完成。2014年，荷蘭代爾夫特理工大學(xué)的MASHAGHI 等[7-8]研究了微生物細(xì)胞分裂過(guò)程中蛋白質(zhì)之間的相互作用，這些蛋白質(zhì)包括FtsA、EzrA、ZapA、SepF、ZipA、FtsE、FtsX、FtsK、FtsQ、FtsB、FtsL、FtsW、FtsI、FtsN、AmiC、EnvC等，表明正是這種復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系使得研究人員能夠利用現(xiàn)有的蛋白對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行調(diào)控，將這些蛋白質(zhì)通過(guò)與FtsZ相互作用對(duì)Z環(huán)形成的影響可以分為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子。

2.1 正向調(diào)控因子對(duì)細(xì)胞分裂的精細(xì)調(diào)控

微生物細(xì)胞分裂的正調(diào)控是指對(duì)分裂過(guò)程起穩(wěn)定和促進(jìn)作用。圖2為細(xì)胞分裂蛋白相互作用示意圖。正向調(diào)控因子包括FtsA、ZipA、ZapA、SepF、FtsE、FtsX和EzrA，它們通過(guò)與FtsZ蛋白相互作用參與細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)，穩(wěn)定Z環(huán)的形成，促進(jìn)細(xì)胞正常分裂。例如，ABC運(yùn)載體FtsE和FtsX可以促進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞分裂，它們向大腸桿菌分裂位置的募集需要FtsZ、FtsA和ZipA，但不需要FtsK、FtsQ和FtsI[9]。而FtsA 和ZipA都是通過(guò)誘導(dǎo)FtsZ原絲形成集束來(lái)穩(wěn)定Z環(huán)的形成，如缺乏其中任何一個(gè)蛋白會(huì)使細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞變長(zhǎng)。EzrA不是通過(guò)與FtsZ而是與FtsA相互作用來(lái)行使功能的，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)EzrA蛋白含量下降時(shí)，枯草芽孢桿菌細(xì)胞長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)[10]。

圖2 細(xì)胞分裂蛋白相互作用

2.2 負(fù)向調(diào)控因子對(duì)細(xì)胞分裂的精細(xì)調(diào)控

微生物細(xì)胞分裂的負(fù)調(diào)控是指對(duì)細(xì)胞分裂過(guò)程起抑制作用。負(fù)向調(diào)控因子包括SulA蛋白、FtsH蛋白和Min系統(tǒng)，它們通過(guò)與FtsZ蛋白相互作用，阻止其聚合和Z環(huán)形成，細(xì)胞停止分裂變成長(zhǎng)的絲狀。在研究SOS介導(dǎo)的細(xì)菌分裂時(shí)首次發(fā)現(xiàn)SulA對(duì)細(xì)胞分裂具有抑制作用[11]，它由169個(gè)氨基酸組成，是一個(gè)高度保守的細(xì)胞分裂抑制因子，可以直接與FtsZ相互作用導(dǎo)致GTP水解無(wú)法進(jìn)行，阻止FtsZ聚合，產(chǎn)生不分裂的長(zhǎng)絲狀細(xì)胞從而抑制細(xì)胞分裂[12]，當(dāng)細(xì)胞暴露在逆境下時(shí)會(huì)產(chǎn)生SOS反應(yīng)，誘導(dǎo)大量SulA蛋白表達(dá)，以避免受損的DNA傳給子代細(xì)胞。而FtsH是一種膜結(jié)合的、需要ATP的Zn2+金屬蛋白，是ATP酶家族中的一員，廣泛存在于真細(xì)菌、古細(xì)菌及真核細(xì)胞中，能夠降解膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白[13]，SRINIVASAN等[14]構(gòu)建了7種FtsZ的N端或C端結(jié)構(gòu)缺失的突變株，證明FtsH對(duì)突變株均有降解作用。

細(xì)菌細(xì)胞的分裂還受到Min系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)控[15]。Min系統(tǒng)包括MinC、MinD和MinE基因，它們?cè)诩?xì)胞兩極上阻止FtsZ聚合，影響細(xì)胞分裂位點(diǎn)的確定，導(dǎo)致Z環(huán)定位異常，細(xì)胞不對(duì)稱分裂產(chǎn)生不含染色體的小細(xì)胞，同時(shí)還會(huì)使細(xì)胞分裂受到抑制，產(chǎn)生不分裂的長(zhǎng)絲狀細(xì)胞。MinC蛋白由231個(gè)氨基酸組成，其N(xiāo)端含有FtsZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域，直接與FtsZ蛋白相互作用，抑制FtsZ蛋白的聚合，從而抑制細(xì)胞分裂[16]。MinC蛋白的C端含有MinD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與其結(jié)合形成MinCD復(fù)合物，MinD蛋白由270個(gè)氨基酸組成，也可以與ATP結(jié)合形成復(fù)合體結(jié)合到細(xì)胞膜上[17]。2013年，DILLON等[18]發(fā)現(xiàn)oxyR基因能夠調(diào)控MinD的表達(dá)，其突變使MinD表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞分裂隔膜無(wú)法形成，細(xì)菌細(xì)胞變長(zhǎng)。MinE是一個(gè)小的功能蛋白，由88個(gè)氨基酸組成[19-21]，它在細(xì)胞中形成螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從細(xì)胞一極向細(xì)胞另一極移動(dòng)，并驅(qū)動(dòng)MinCD復(fù)合物在細(xì)胞兩極間移動(dòng)。

2.3 細(xì)胞分裂調(diào)控產(chǎn)物的合成

聚羥基脂肪酸酯是一種可生物降解的環(huán)境友好型塑料，2014年，清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)課題組[22]為提高聚3-羥基丁酸脂PHB和3-羥基,4-羥基脂肪酸共聚酯P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)量，在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)sulA使得大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)絲狀，不僅增大了細(xì)胞空間，而且使目標(biāo)產(chǎn)物PHB和P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)量與對(duì)照相比分別提高了104%和10%。另外，外界添加某些化合物如3-甲氧基苯甲酰胺能夠抑制ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶，并作用于FtsZ，微弱地抑制枯草芽孢桿菌的分裂，導(dǎo)致細(xì)胞溶解[23]；血根堿能夠阻止FtsZ的聚集，干擾大腸桿菌和枯草芽孢桿菌細(xì)胞分裂過(guò)程中Z環(huán)的形成，具有抗菌活性[24]；紫杉烷類化合物能使結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞形成長(zhǎng)絲狀菌體，具有顯著的抗肺結(jié)核活性[25]；PARADIS-BLEAU 等[26]合成了一系列GTP類似物GAL，能夠像GTP一樣結(jié)合到FtsZ上，使得GTP水解無(wú)法進(jìn)行，大腸桿菌生長(zhǎng)受到抑制。

3　必需基因的調(diào)控與微生物代謝

必需基因是組成細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信息傳遞和加工不可或缺的，其突變或丟失通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[27]。必需基因的數(shù)量和功能在不同種類的微生物中差別顯著，HUTCHISON等[28]通過(guò)基因定位插入失活分析，證明肺炎支原體中有387個(gè)必需基因，但其中28%的功能未知。日本和歐盟研究組[29]用相同的方法證明芽胞桿菌中有271個(gè)必需基因，它們是細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊、能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝必不可少的。MORI課題組[30]通過(guò)單基因敲除證明大腸桿菌K12的4288個(gè)基因中有341個(gè)必需基因，其中有59個(gè)功能未知，具體見(jiàn)表2。

甾醇是釀酒酵母細(xì)胞膜的重要成分之一，也是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要物質(zhì)，甾醇合成途徑是多酶體系參與的復(fù)雜過(guò)程，其中的角鯊烯合成酶編碼基因Erg9是釀酒酵母的必需基因，其敲除會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而，PARADISE研究組[31]通過(guò)下調(diào)青蒿酸合成中分支途徑關(guān)鍵基因Erg9的表達(dá)，將目標(biāo)產(chǎn)物青蒿酸的產(chǎn)量提高到了100mg/L。必需基因敲除或丟失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)通常是致死的，但是2014年清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)課題組[32]對(duì)大腸桿菌中的細(xì)胞呼吸必需基因hemD進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞并沒(méi)有全部死亡，而是仍有少量生長(zhǎng)。2015年，哈佛醫(yī)學(xué)院MANDELL等[33]將大腸桿菌改造成營(yíng)養(yǎng)缺陷體，在其基因組很多位置摻入了人工合成的氨基酸，使其必須依賴這些氨基酸存活，通過(guò)這種方法最終使得大腸桿菌的逃逸率降低到10–12。

表2 大腸桿菌K12的必需基因及功能

4　程序化死亡調(diào)控與微生物代謝

微生物在不良生長(zhǎng)環(huán)境下可以自發(fā)地抑制生長(zhǎng)速度，甚至?xí)园l(fā)性死亡以維持整個(gè)種群的生存。1997年，德國(guó)蒂賓根大學(xué)的MADEO等[34]在研究釀酒酵母的細(xì)胞分裂周期基因cdc48時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，并稱之為真菌細(xì)胞凋亡；與真菌相似，細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)表現(xiàn)出群體行為，為了維持菌群生存表現(xiàn)出與真菌細(xì)胞凋亡相似的特點(diǎn)，命名為細(xì)菌程序性細(xì)胞死亡。細(xì)菌和真菌的這兩種機(jī)制都是為了維持種群延續(xù)采取的一種利他方式，但是由于細(xì)菌和真菌的結(jié)構(gòu)差異和生存環(huán)境的不同，它們程序化死亡的機(jī)制是有區(qū)別的。

4.1 真菌細(xì)胞凋亡

真菌細(xì)胞凋亡機(jī)制與細(xì)菌不同之處在于不存在細(xì)菌特有的毒素-抗毒素系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)，大約40%是由胱天蛋白酶介導(dǎo)的，而胱天蛋白酶非依賴的凋亡途徑主要與線粒體內(nèi)的凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶有關(guān)。

4.1.1 細(xì)胞凋亡正調(diào)控機(jī)制

細(xì)胞凋亡的正調(diào)控是指對(duì)凋亡過(guò)程起促進(jìn)作用。正調(diào)控因子包括細(xì)胞色素C、肌動(dòng)蛋白、NADH氧化酶、核酸內(nèi)切酶和活性氧自由基等，大部分通過(guò)激活胱天蛋白酶引起凋亡，它在真菌凋亡中起核心作用[35]。例如，細(xì)胞色素C是線粒體電子傳遞鏈的重要組成部分，通常位于線粒體膜間隙，在凋亡因素刺激下從線粒體釋放到胞漿與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合，誘導(dǎo)其變構(gòu)并寡聚化形成寡聚體，進(jìn)一步結(jié)合前胱天蛋白酶，激活胱天蛋白酶引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[36]。肌動(dòng)蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，其表達(dá)水平與細(xì)胞形態(tài)變化密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡時(shí)，肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基累積，而肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定性的提高能明顯降低細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基水平，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[37]。NADH氧化酶在能量代謝和氧化還原代謝中發(fā)揮作用，在凋亡因素的刺激下被某些蛋白酶水解，從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，然后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，降解核DNA和質(zhì)粒 DNA，引起DNA斷裂和染色體凝集，NADH氧化酶過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)過(guò)氧化氫所致的細(xì)胞凋亡[38]?；钚匝踝杂苫粌H可以氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子引起細(xì)胞損傷，而且可以激活胱天蛋白酶引起細(xì)胞凋亡[39]。

4.1.2 細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控機(jī)制

細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控是指對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程起延緩作用，凋亡抑制蛋白通過(guò)與胱天蛋白酶結(jié)合，抑制其與底物的結(jié)合，發(fā)揮抗凋亡作用。負(fù)調(diào)控因子包括凋亡抑制蛋白和超氧化物歧化酶等，例如，Bir1p是真菌中唯一的凋亡抑制蛋白家族成員[40]，其過(guò)表達(dá)可以保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化氫或衰老導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，在紡錘體穩(wěn)定及細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用。同樣，超氧化物歧化酶過(guò)表達(dá)可降低細(xì)胞中活性氧自由基的含量，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[39]。

4.2 細(xì)菌程序性細(xì)胞死亡

細(xì)菌的程序性細(xì)胞死亡是由其自身的基因調(diào)控的，分為兩類：一類發(fā)生在細(xì)菌功能性分化時(shí)，另一類是由毒素-抗毒素系統(tǒng)介導(dǎo)的，近幾年的研究工作主要針對(duì)后者。

毒素-抗毒素系統(tǒng)由一對(duì)編碼特定組分的基因組成，下游基因編碼的毒素穩(wěn)定，可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；上游基因編碼的抗毒素不穩(wěn)定，可以使毒素失活。正常情況下這兩種物質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)維持動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害。毒素-抗毒素系統(tǒng)中的毒素是蛋白質(zhì)，它通過(guò)影響細(xì)菌DNA的復(fù)制、mRNA穩(wěn)定性、細(xì)胞分裂和ATP合成等多種方式發(fā)揮毒性作用，根據(jù)抗毒素種類的不同可以分為五種類型。類型Ⅰ中的抗毒素為不穩(wěn)定的反義RNA分子，2013年NATALIE等[41]證實(shí)在枯草芽孢桿菌中，抗毒素SR4不僅會(huì)抑制毒素bsrG mRNA的翻譯，而且會(huì)促進(jìn)毒素bsrG mRNA的降解。類型Ⅱ中的抗毒素為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)[42]，與毒素結(jié)合形成復(fù)合物抑制它的毒性作用。類型Ⅲ中的抗毒素為RNA，2013年SAMSON等[43]證實(shí)AbiQ蛋白是一種核糖核酸內(nèi)切酶，在體內(nèi)特異的切割其同源的抗毒素RNA。類型Ⅳ中的抗毒素為蛋白質(zhì)，但是它不是和毒素形成復(fù)合物，而是直接抑制毒素在細(xì)胞靶點(diǎn)的作用來(lái)抑制它的毒性，2013年MASUDA 等[44]在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)Ⅳ型系統(tǒng)，毒素CbtA能抑制細(xì)菌骨架蛋白MreB和細(xì)胞分裂蛋白FtsZ的聚合，而抗毒素YeeU能夠增強(qiáng)它們的聚合。類型Ⅴ中的抗毒素為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，2012年WANG 等[45]首次發(fā)現(xiàn)了Ⅴ型系統(tǒng)，毒素GhoT可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，抗毒素作為一種序列特異性的核酸內(nèi)切酶切割GhoT的mRNA從而阻止其翻譯。

4.3 微生物程序化死亡調(diào)控群體數(shù)量

2015年，美國(guó)耶魯大學(xué)的GALLAGHER等[46]在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)毒素-抗毒素基因線路，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pBAD調(diào)控表達(dá)的EcoRI核酸內(nèi)切酶通過(guò)剪切大腸桿菌基因組EcoRI位點(diǎn)使細(xì)胞死亡，同理，pLtetO調(diào)控表達(dá)的EcoRI甲基化酶能保護(hù)基因組上的EcoRI甲基化位點(diǎn)免受EcoRI核酸內(nèi)切酶的切割，最終大腸桿菌的逃逸率僅為9.4×10–7，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控。細(xì)菌程序性細(xì)胞死亡也是一種細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的行為，細(xì)菌密度達(dá)到一定閾值時(shí)通過(guò)信號(hào)分子來(lái)啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，在合成生物學(xué)領(lǐng)域，群體感應(yīng)被廣泛用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)菌的很多生理功能，例如毒素產(chǎn)生、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和抗生素合成等。目前最普遍的群體感應(yīng)分子是高絲氨酸內(nèi)酯AHL，如圖3所示。1997年DENNY等[47]發(fā)現(xiàn)在青枯菌中存在一種群體感應(yīng)分子3-羥基棕櫚酸甲酯可以調(diào)節(jié)青枯菌的密度；2000年DONG等[48]在芽孢桿菌240B1中克隆到了世界上第一個(gè)AHL內(nèi)酯酶基因aiiA，它表達(dá)的蛋白可以水解AHL的內(nèi)酯鍵，鈍化其活性并破壞病原菌群體感應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)，使病原菌死亡；2005年P(guān)ARK等[49]從鏈霉菌M664菌株中克隆到了能夠降解AHL的基因ahlM，表達(dá)的蛋白也能夠降低病原菌的毒性。

圖3 革蘭氏陰性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)

5　外界環(huán)境對(duì)微生物生長(zhǎng)的調(diào)控

影響微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境因素主要包括溫度、pH、溶氧量等，適宜的環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，提高產(chǎn)品的合成速率和產(chǎn)量，而不良環(huán)境條件對(duì)微生物細(xì)胞的影響表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：抑制細(xì)胞的分裂及其生長(zhǎng)，影響蛋白質(zhì)合成使其變性聚集，破壞細(xì)胞骨架，阻斷細(xì)胞代謝，降低細(xì)胞活力等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。例如，在微生物呼吸過(guò)程中，氧氣還原為水的同時(shí)形成某些有毒的中間產(chǎn)物如過(guò)氧化氫、超氧陰離子等[50]，它們可直接作用于代謝途徑中關(guān)鍵基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，對(duì)微生物功能產(chǎn)生不利影響，使細(xì)胞處于死亡的邊緣。然而好氧微生物由于具有降解這些產(chǎn)物的酶，如過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶使得細(xì)胞不受破壞，嚴(yán)格厭氧菌由于缺乏這些酶，容易受其毒害致死。生物制造過(guò)程控制如圖4所示。

6　結(jié) 語(yǔ)

微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)與調(diào)控在產(chǎn)物合成過(guò)程中有著舉足輕重的作用。目前，利用分子生物學(xué)、合成生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)已經(jīng)初步闡明了細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制，在細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制的基礎(chǔ)上靈活地調(diào)控細(xì)胞密度，控制細(xì)胞生長(zhǎng)速率和產(chǎn)品合成效率，在推動(dòng)我國(guó)生物制造業(yè)向規(guī)模化、集成化、智能化、綠色化發(fā)展方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 生物制造過(guò)程控制

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Regulation and control of microbial growth in bio-manufacturing processes

HOU Hui，LI Chun
（Department of Biological Engineering，School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Abstract：Improving the yield and production efficiency of bio-based products is the goal of bio-manufacturing and bio-industry. Because of the advantages of fast growth，simple nutritional requirement and convenient gene manipulation，microorganisms are often used as chassis of bio-based products. Thus，the growth regulation and control of microbial cells are particularly important in the process of bio-manufacturing，as the microbial cell growth will directly or indirectly affect the synthesis efficiency of bio-based products. The growth of microorganisms can be affected not only by external conditions such as temperature，dissolved oxygen and pH，but also by their own cell growth mechanism. The cell growth mechanism can be referred to cell division regulation，essential genes expression regulation and programmed cell death. This paper reviewed the molecular regulation of microbial cell growth and division through molecular biology，synthetic biology and systematic biology methods to improve the biological reaction rate and the yield of target products，which provides new insights for the development of efficient bio-manufacturing process in chemical engineering，food industry，bio-pharmaceuticals，environmental protection and other fields.

Key words：bio-manufacturing；cell growth；cell division regulation；essential genes；programmed cell death；bio-industry

中圖分類號(hào)：Q 81

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000–6613（2016）06–1837–08

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.06.025

收稿日期：2015-11-26；修改稿日期：2015-12-15。

基金項(xiàng)目：國(guó)家杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21425624）。