肖文海，周嗣杰，王穎，元英進

（1天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；2天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)平臺，天津 300072）

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如何工程化生物學(xué)

肖文海1，2，周嗣杰1，2，王穎1，2，元英進1，2

（1天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；2天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)平臺，天津 300072）

摘要：隨著化學(xué)學(xué)科的發(fā)展和應(yīng)用需求，化學(xué)工程應(yīng)運而生；隨著生物學(xué)的發(fā)展和工程化需求，代表著“生物學(xué)第三次革命”的合成生物學(xué)也隨之誕生。合成生物學(xué)，即生物學(xué)的工程化，它從工程學(xué)角度設(shè)計創(chuàng)建元件、器件或模塊，以及通過這些元器件改造和優(yōu)化現(xiàn)有自然生物體系，但是如何對復(fù)雜生命進行工程化一直是合成生物學(xué)工作者不斷探索的重大科學(xué)問題。本文系統(tǒng)地闡釋了迄今為止工程化生物學(xué)的4個特點：①模塊化和標準化；②正交性；③魯棒性；④適配性及其對應(yīng)研究進展。最后從“設(shè)計-構(gòu)建-測試”循環(huán)的研究模式入手提出了今后如何進一步有效地工程化生物學(xué)。

關(guān)鍵詞：合成生物學(xué)；模塊化；正交性；魯棒性；適配性；“設(shè)計-構(gòu)建-檢測”循環(huán)

第一作者：肖文海（1982—），男，研究員，研究方向為合成生物學(xué)。

聯(lián)系人：元英進，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail yjyuan@tju.edu.cn。

生物學(xué)研究多年來一直沿著從整體到局部，從個體到器官、組織直到各種細胞和分子的模式，各種計算生物學(xué)和實驗系統(tǒng)生物學(xué)的方法得到了很大發(fā)展，促進了人們對微觀生物分子（DNA、蛋白質(zhì)、RNA、代謝物）之間的相互作用和復(fù)雜表現(xiàn)的更好理解。然而，即使人們對所有這些細節(jié)都研究清楚了，仍然不理解生物作為一個整體是如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用的，生物從最開始是如何從簡單到復(fù)雜進化的。類比化學(xué)學(xué)科，隨著化學(xué)學(xué)科的發(fā)展和應(yīng)用需求，化學(xué)工程應(yīng)運而生；隨著生物學(xué)的發(fā)展和對其應(yīng)用需求的增加，生物學(xué)的工程化成為必然。合成生物學(xué)，即生物學(xué)的工程化，從工程學(xué)角度設(shè)計創(chuàng)建元件、器件或模塊，以及通過這些元器件改造和優(yōu)化現(xiàn)有自然生物體系（圖1），或者設(shè)計合成具有預(yù)定功能的全新人工生物體系，實現(xiàn)合成生物體系在化學(xué)品、醫(yī)藥、重大疾病的診斷與治療、農(nóng)業(yè)、能源、環(huán)境等領(lǐng)域的規(guī)?；瘧?yīng)用，同時加深人類對生命本質(zhì)的理解[1-6]。合成生物學(xué)從電氣工程、化學(xué)工程、土木工程和機械工程等工程科學(xué)進行了借鑒（圖1），提供一條從“局部到整體”的研究思路和方法，即“自下而上”的途徑，通過構(gòu)筑人工生物系統(tǒng)以更好地理解天然生物系統(tǒng)的工作原理，從單一離散的基因元器件到模塊，再到整個生物的網(wǎng)絡(luò)，對原有生物體系自然功能進行改造或使生物系統(tǒng)實現(xiàn)全新的功能，直至“人造生命”。從這一角度來說，合成生物學(xué)理論和方法的引入，將會極大地促進人們對生物學(xué)重大基本問題的研究和解析，拓展生命科學(xué)的視野。合成生物學(xué)促進了對生命密碼從“讀”到“寫”的質(zhì)變，打開了從非生命化學(xué)物質(zhì)向生命物質(zhì)轉(zhuǎn)化的大門，將生命科學(xué)引入“多學(xué)科會聚”研究的第三范式，催生了繼DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)和基因組測序之后的“第三次生物科學(xué)革命”。世界主要發(fā)達國家紛紛制定新的生物技術(shù)戰(zhàn)略，合成生物學(xué)已經(jīng)成為各國明確爭搶的科技高地。2012年美國國防部率先啟動了一個1.4億美元的“生命鑄造廠”計劃（Living Foundries），將細胞作為工廠制造新分子、新材料，并強調(diào)更加廣泛地利用合成生物學(xué)，集中創(chuàng)建一個以生物學(xué)為基礎(chǔ)的生產(chǎn)平臺，以期創(chuàng)造其再工業(yè)化、領(lǐng)先國際的新實力[7]。2014年6月，世界經(jīng)濟合作與發(fā)展組織簡稱經(jīng)合組織（OECD）發(fā)表題為“Emerging Policy Issues in Synthetic Biology”的報告，建議各國政府以創(chuàng)新方式促進合成生物學(xué)發(fā)展[8]。2013年美國能源部對美國國會發(fā)表合成生物學(xué)國會報告[9]；2014年5月美國國防部系統(tǒng)介紹了其2013 —2017年科技發(fā)展計劃，提出了未來重點關(guān)注的六大顛覆性基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，合成生物學(xué)是其中之一[10]；2015年美國發(fā)布了《生物技術(shù)工業(yè)化：化學(xué)品先進制造路線圖》，將合成生物學(xué)列為核心發(fā)展技術(shù)之一[11]。麥肯錫全球研究所發(fā)布的研究報告將合成生物學(xué)評價為未來的十二大顛覆性技術(shù)之一，預(yù)測2025年合成生物學(xué)和工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)值將達到1000億美元左右[12]。英國商業(yè)創(chuàng)新技能部將合成生物學(xué)列為支撐該國未來經(jīng)濟成長的八大技術(shù)之一，預(yù)測2020年合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)規(guī)模將達620億英鎊[13]。

圖1 生物學(xué)工程化——合成生物學(xué)

作為工程化的科學(xué)，合成生物學(xué)的發(fā)展符合我國經(jīng)濟轉(zhuǎn)型升級的戰(zhàn)略需求。隨著我國經(jīng)濟的高速發(fā)展，高能耗、高污染、大規(guī)模的傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)展已經(jīng)不適應(yīng)社會發(fā)展的需求。而合成生物學(xué)正在對現(xiàn)代工業(yè)產(chǎn)生革命性的影響。人類賴以生存的化學(xué)品、燃料等制造，正面臨著原料路線從化石資源向可再生生物資源轉(zhuǎn)移、加工路線從化學(xué)制造向生物制造轉(zhuǎn)移兩個不可避免的變革。我國資源對外依存度不斷加深、節(jié)能減排壓力巨大。利用合成生物學(xué)設(shè)計有機化學(xué)品的高效合成路線和人工生物體系，不僅有可能高效利用原來不能利用的生物質(zhì)資源，也有可能高效合成原來不能生物合成或者原來生物合成效率很低的化工產(chǎn)品。這將為突破自然生物體合成功能與范圍的局限，打通傳統(tǒng)化學(xué)品的生物合成通道，為發(fā)展先進生物制造技術(shù)、促進可持續(xù)經(jīng)濟體系形成與發(fā)展，提供重大機遇。2015年8月3日美國市場研究咨詢機構(gòu)透明市場研究（Transparency Market Research）公司最新研究報告顯示：從2013年到2019年合成生物學(xué)技術(shù)市場將保持32.6%的年增長速率（是世界經(jīng)濟增長率的10倍），最終達到134億美元的規(guī)模[14]。合成生物學(xué)將以重新“設(shè)計合成”的視角創(chuàng)新化工產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、能源資源產(chǎn)業(yè)、環(huán)境產(chǎn)業(yè)等的發(fā)展，推動關(guān)鍵技術(shù)瓶頸的突破和新型技術(shù)的引入，重點推進我國在生物制造、生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)及技術(shù)轉(zhuǎn)讓、產(chǎn)業(yè)化過程的發(fā)展。

1　生物學(xué)工程化特性及研究進展

作為工程化的生物學(xué)，與其他工程科學(xué)類似，合成生物學(xué)具備4個方面的工程化特點（圖1）：①功能元件的模塊化和標準化；②人工元器件與底盤的正交性；③人工合成系統(tǒng)的魯棒性；④人工合成系統(tǒng)的物質(zhì)代謝與能量代謝適配性。下文將對這4個方面的工程化特性及其研究進展進行闡釋和說明。

1.1 功能元件的標準化

合成生物學(xué)的本質(zhì)是生物學(xué)的工程化，其核心思想就是設(shè)計和構(gòu)建元件模塊或者改造現(xiàn)有的模塊，然后再與底盤集成從而獲得工程化人工生物體系，因此元件、模塊和底盤是合成生物學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)。模塊的設(shè)計和構(gòu)建包括元器件優(yōu)化設(shè)計和模塊設(shè)計組裝。功能元件設(shè)計的最終目標是實現(xiàn)如電子工程和機械工程一樣的“即插即用”。要實現(xiàn)“即插即用”，功能元件必須具備如下4個特點，即標準化（如具有類似的序列結(jié)構(gòu)或接口）、信息化（生物學(xué)數(shù)據(jù)要詳盡）、分工化（執(zhí)行特定的生物學(xué)功能）、可替換（如某個元件可被強度不同的同類元件替代，實現(xiàn)微調(diào)），以滿足實現(xiàn)生物功能從頭設(shè)計與構(gòu)建的需要。在構(gòu)建合成模塊時，需將不同的啟動子、核糖體結(jié)合位點、終止子、功能基因、選擇標簽等具有特定動能的序列進行標準化、元件化[15]。需要設(shè)計和構(gòu)建如下元件并建庫：①基本基因元件；②基因表達的調(diào)控元件；③降解控制元件；④信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件；⑤物質(zhì)轉(zhuǎn)運元件等。同時根據(jù)合成生物系統(tǒng)構(gòu)建的需求來設(shè)計功能模塊，除了一般的邏輯模塊、代謝模塊和調(diào)控模塊以外，還將關(guān)注以下模塊并建庫：①糖轉(zhuǎn)運和代謝模塊；②能量（輔因子）代謝模塊；③耐受性和抗毒性模塊；④響應(yīng)供氧模塊；⑤活性結(jié)構(gòu)單元合成模塊；⑥產(chǎn)物及特殊中間代謝物轉(zhuǎn)運模塊；⑦纖維素降解模塊；⑧光合作用固碳模塊；⑨人工固氮模塊；⑩疾病的特異性識別模塊；疾病治療模塊；疾病治療的調(diào)控模塊；表觀遺傳修飾模塊等。然后按照既定設(shè)計，選取特定的元器件進行拼接組裝[16]，進而構(gòu)建合成模塊。

建立開放的、通用的、可以和其他數(shù)據(jù)庫兼容的元件模塊庫是是促進元件標準化蓬勃發(fā)展的重要途徑和基石[圖2(a)]。2003年成立于MIT的BioBricks元件庫（2006年已經(jīng)更名為BioBricks Foundation，現(xiàn)在是基金會形式運作，主頁為http：//partsregistry.org/）[17-18]是合成生物學(xué)標準化元件庫歷史上里程碑意義的事件[圖2(a)]。隨著國際基因組設(shè)計大賽（iGEM，International Genetically Engineered Machine Competition）的影響日益廣泛，BioBricks元件庫已經(jīng)擁有超過2萬個元件和模塊。在美國自然基金會資助下，由加州理工大學(xué)伯克利分校和斯坦福大學(xué)于2009年合作建立的另外一個大型元件庫（Biofab，International Open Facility Advancing Biotechnology，主頁為http：//biofab. synberc.org/），在元件收集的基礎(chǔ)上，同時側(cè)重于標準化元件設(shè)計構(gòu)建和表征等方面的研究，并且和美國勞倫斯伯克利國家實驗室、BioBricks Foundation等建立了很好的合作關(guān)系。我國在元件庫建設(shè)方面，計算設(shè)計與合成表征了滿足不同化學(xué)品生物合成的功能元件，形成了包含數(shù)千個功能特性清晰的功能元件和模塊的實體庫[圖2(a)]，尤其天津大學(xué)在國家重大項目支持下建立了目前世界上最大的生物元件和模塊的實體庫，現(xiàn)階段已經(jīng)包含超過一萬個生物元件和模塊，涵蓋基礎(chǔ)代謝、異源表達和分解代謝3個主要方面，并且已經(jīng)和國內(nèi)多家單位建立了良好的共享合作機制（www.synbioml.org） 。該元件模塊庫有著如下4個方面的優(yōu)點：①標準化，具有統(tǒng)一的內(nèi)切酶位點的元件模塊化設(shè)計；②信息化，開放式元件模塊庫的信息管理；③分工化，以功能為單位的元件模塊庫分工構(gòu)建管理；④可替換，高度可操縱性的模塊無縫集成組裝。

圖2 元件模塊標準化進展

基于合成生物學(xué)是生物學(xué)，工程學(xué)、計算機、物理等多學(xué)科交叉的特點，成立包含學(xué)術(shù)界、政府和商業(yè)化組織在內(nèi)的公共交流和服務(wù)平臺也是促進元件標準化和資源共享的有效途徑。2008年成立的SBOL（The Synthetic Biology Open Language）給合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究者提供了一個大型的國際化、標準化交流平臺[19][圖2(b)和(c)]。成立之初有37個組織參與，其中學(xué)術(shù)組織23個，商業(yè)組織11個，政府組織2個以及1個獨立組織。該平臺成立的初衷在于建立一個國際化的、跨組織的標準化、基因設(shè)計交流和分享平臺，同時也能結(jié)合多學(xué)科交叉優(yōu)勢進行系統(tǒng)的基因設(shè)計。其核心數(shù)據(jù)模型如圖2(b)所示。該平臺集合平臺中6家不同背景的單位快速的、全鏈條和系統(tǒng)的從設(shè)計、優(yōu)化、合成、元件模塊儲藏等方面合作重構(gòu)了James COLLIN 2000年發(fā)表在《Nature》雜志上的穩(wěn)態(tài)開關(guān)。這也從側(cè)面說明了建立這種標準化的公共服務(wù)和交流平臺對合成生物學(xué)的巨大促進作用。該平臺也從當初的1.0版本迅速的升級到了2.0版本，應(yīng)用和受眾更廣泛[20]。

1.2 人工元器件與底盤的正交性

導(dǎo)入的人工元器件與底盤網(wǎng)絡(luò)保持一定的正交性，不干擾底盤已有調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以減少人工設(shè)計的復(fù)雜性。目前可用于合成的正交生物元器件與生物模塊不論在質(zhì)量上還是在數(shù)量上還遠遠不能滿足合成生物學(xué)的要求，需進一步研究不同層次（基因、RNA、蛋白等）生物元器件的正交設(shè)計、定量表征與實驗驗證，例如蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄的正交元件、RNA聚合酶的正交元件、核糖體結(jié)合功能位點的正交元件等。下文將從DNA、RNA和蛋白正交元件3個方面的研究進展（圖3）來闡述人工生物體系正交性。

在DNA正交元件研究中，RAO[21]從正交轉(zhuǎn)錄因子[22]、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的正交核糖體[23]、翻譯調(diào)控的正交核糖體[24]和正交的兩組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系[25]等方面系統(tǒng)綜述了在細菌中如何同時實現(xiàn)對多個基因的正交調(diào)控；位點特異性重組酶是實現(xiàn)在真核體系中基因編輯的有力工具。如重組酶Cre將反轉(zhuǎn)或刪除由兩個loxP位點側(cè)接靶向DNA區(qū)域，當重組酶Cre執(zhí)行基因反轉(zhuǎn)時將實現(xiàn)基因重排。LIN等[26]設(shè)計了兩套位點特異性重組酶系統(tǒng)最終實現(xiàn)對釀酒酵母基因組的正交重組。這兩個重組酶系統(tǒng)分別是Cre-loxP和Vika-VOX。這兩個系統(tǒng)屬于同一個酪氨酸重組酶家族，雖然它們在DNA識別位點的序列和二級結(jié)構(gòu)上有較高相似性，但是驗證它們的識別過程是正交的。該工作為在真核體系實現(xiàn)對基因組的正交編輯提供了很好的研究方向。

圖3 人工元器件與底盤的正交性研究進展

在RNA正交元件研究方面，各種正交核糖體開關(guān)在原核和真核體系中得到了廣泛的應(yīng)用。CHIN 等[27]在大腸桿菌中重構(gòu)了rRNA的操縱子，使得用于正交核糖體合成的16S rRNA的合成過程與使用其他rRNA的操縱子的過程獨立，進而獲得了最小的調(diào)控模塊可以用于正交核糖體的表達調(diào)控。這個最小的正交核糖體元件可以用于理性的改善正交轉(zhuǎn)錄－翻譯前饋控制中的延遲問題。研究發(fā)現(xiàn)雖然核糖體及延伸因子（elongation factors，EF）具有比較寬廣的識別tRNA能力，但是識別效率會下降。例如采用琥珀密碼子編碼非天然氨基酸時，由于受到釋放因子的干擾，識別效率會下降至正常的20%～30%。所以需要篩選的核糖體不僅是正交的而且還能夠高效識別這些擴展的密碼子。NEUMANN等[28]用定向進化方法獲得了一個正交核糖體（ribo-Q1），能有效解碼一系列四聯(lián)密碼子和琥珀密碼子，通過正交的aaRS/tRNA組合并結(jié)合正交核糖體，直接在對應(yīng)mRNA上兩個新空白密碼子的位置摻入了不同的UAA。

在蛋白正交元件研究方面，各種正交蛋白體系被廣泛應(yīng)用于細胞基因編輯和表達調(diào)控中。正交的Cas9蛋白就是其中典型的例子。釀膿鏈球菌來源的Cas9蛋白可以在在基因組的多點實現(xiàn)一種功能，如編輯、激活或者抑制，但是不能同時實現(xiàn)上述所有的功能。CHURCH等[29]在大腸桿菌和人體細胞中構(gòu)建和篩選出了正交的Cas9核酸酶體系，可以實現(xiàn)單個細胞基因組的多點同時進行編輯、RNA介導(dǎo)的激活和抑制等功能。同時細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于調(diào)控蛋白之間的相互作用，更加精確地控制這些相互反應(yīng)是工程化細胞功能的關(guān)鍵。人工設(shè)計正交的蛋白質(zhì)接口，能夠有效地避免來自于宿主細胞本身信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的干擾，進而實現(xiàn)蛋白質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)的工程簡化和提升。KAPP等[30]通過計算機輔助設(shè)計了正交的重要信號蛋白GTPase （orthoCdc42）和它的特異激活因子。經(jīng)過在哺乳動物細胞實驗驗證表明，這個正交的蛋白體系在實現(xiàn)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的同時而不受細胞本身信號系統(tǒng)的影響。

1.3 人工合成系統(tǒng)的魯棒性

人工合成系統(tǒng)的魯棒性是指生物在受到外部或內(nèi)部擾動時，生物系統(tǒng)保持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的特性。與穩(wěn)定性強調(diào)功能的維持相比，魯棒性更強調(diào)功能的迅速恢復(fù)。產(chǎn)生魯棒性的作用機制是生物系統(tǒng)的協(xié)調(diào)、冗余、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。一方面，獲得魯棒性的合成生物系統(tǒng)，可通過細胞進化手段，結(jié)合高通量篩選，獲得優(yōu)勢細胞株。尤其是代謝路徑的異源表達方面，宿主細胞系統(tǒng)對新代謝路徑的識別和配合是實現(xiàn)在環(huán)境擾動情況下人工合成細胞體系中目標路徑代謝流穩(wěn)定和最大化的關(guān)鍵。其中通過人工設(shè)計元器件來實現(xiàn)對代謝網(wǎng)絡(luò)的多點調(diào)控就是其中有效的增強體系魯棒性的重要途徑之一。LIM等[31]通過構(gòu)建被Cas9蛋白誘導(dǎo)的同時編碼目標位點和調(diào)控的RNA支架，在酵母體內(nèi)實現(xiàn)了對代謝網(wǎng)絡(luò)中目標代謝多基因激活的同時對其他一些支路基因的抑制。這種RNA支架的應(yīng)用能夠?qū)τ趶?fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝的調(diào)控和重構(gòu)起到巨大的促進作用（圖4）。通過降低生物系統(tǒng)本身的系統(tǒng)噪聲進而減弱其對目標路徑的干擾也是提高系統(tǒng)整體魯棒性的重要手段。微RNA雖然是非編碼的小RNA，卻能通過增強信使RNA的降解或者翻譯抑制來調(diào)節(jié)很多蛋白的表達水平[32]，對生物體內(nèi)微RNA進行人工調(diào)控是能夠有效降低系統(tǒng)噪聲的重要研究方向之一。美國麻省理工學(xué)院DI BERNARDO等[33]首先在中國倉鼠卵巢細胞中建立了微RNA介導(dǎo)的基于蛋白表達水平的雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)。數(shù)學(xué)建模和實驗都發(fā)現(xiàn)微RNA的介導(dǎo)使得該雙穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)維持以及切換魯棒性增強。一旦缺失微RNA的介導(dǎo)，在蛋白水平的噪聲會大幅度上升，進而導(dǎo)致體系會隨機在“開”和“關(guān)”的兩個狀態(tài)之間切換，魯棒性下降（圖4）。群體響應(yīng)因子（QS）的不同密度會對細胞整體的生長和生產(chǎn)特性產(chǎn)生極大的影響，這也為研究人員通過人工設(shè)計QS介導(dǎo)的控制系統(tǒng)來提高體系的魯棒性奠定了理論基礎(chǔ)。美國杜克大學(xué)的YOU研究團隊[34]在大腸桿菌體系通過比較3種調(diào)控策略：①細胞處在脅迫條件下，生長緩慢且胞外酶停止表達，整個體系處于“關(guān)”的狀態(tài)；②胞外酶高效表達且有利于緩解外界脅迫，整個體系處于“開”的狀態(tài)；③群體響應(yīng)因子LuxR/LuxI體系介導(dǎo)的控制體系。結(jié)果證明，第三種策略對于不同的接種量和培養(yǎng)時間的變化都顯現(xiàn)出更好的系統(tǒng)魯棒性（圖4）。

圖4 人工合成體系魯棒性研究進展

另一方面，如何設(shè)計合理“冗余性”的功能模塊，理性構(gòu)建出人工系統(tǒng)的冗余性，也是需要探索的方向。其中關(guān)于最小基因組的研究就是有效的手段之一。無論從物質(zhì)代謝還是從能量代謝經(jīng)濟性的角度，含有去除了冗余基因的較小基因組的細胞都是更為魯棒和高效的。OGASAWARA等[35]通過逐步刪減的辦法將基因組大小從原始大腸桿菌菌株（MGF-01）的3.62Mb刪減到3.27Mbp和2.98Mbp，同時在構(gòu)建過程中插入了兩個突變ilvG 和 rph 來加速細胞在延滯期的生長，最終獲得了基因組較小，但是在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長特性更佳的宿主細胞（圖4）。

1.4 人工合成系統(tǒng)的物質(zhì)代謝與能量代謝適配性

人工合成系統(tǒng)的物質(zhì)代謝與能量代謝適配性即是底盤物質(zhì)代謝與能量代謝的改變與人工線路的互動、造成的相互影響。不同的模塊以及模塊之間，在不同的底盤生物中存在著復(fù)雜的交互影響，很大部分是不利于系統(tǒng)高效發(fā)揮功能的。合成生物系統(tǒng)需具備高效發(fā)揮功能的適配性。從代謝網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、蛋白作用網(wǎng)絡(luò)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)等多個層次，對模塊與底盤的內(nèi)在聯(lián)系、調(diào)控規(guī)律進行發(fā)掘，深入解析適配機理，最終實現(xiàn)模塊功能的最大化和穩(wěn)定發(fā)揮之間的平衡點。下文將從模塊和模塊之間、模塊和底盤細胞之間以及人工混菌體系中細胞和細胞之間的適配性3個方面來進行闡述。

模塊和模塊之間的適配性研究方面，主要通過調(diào)節(jié)模塊之間的表達強度以及對關(guān)鍵酶的改造等手段來實現(xiàn)目標代謝路徑代謝流的最優(yōu)化。KOFFAS 等[36]（圖5）在大腸桿菌體內(nèi)模塊化的構(gòu)建了3個模塊：乙酰輔酶A生成模塊、乙酰輔酶A激活模塊和脂肪酸合成模塊來實現(xiàn)脂肪酸的生物合成。通過對變化不同的啟動子和拷貝數(shù)來實現(xiàn)對上述3個模塊的表達調(diào)控和適配，最終使得脂肪酸產(chǎn)量達到8.6g/L，這是當時最高的產(chǎn)量。AJIKUMAR等[37]將紫杉二烯的合成途徑通過模塊化構(gòu)建到大腸桿菌體系中，分為上游前體IPP生成模塊和下游紫杉二烯合成模塊，并通過組合設(shè)計的原則將不同強度啟動子和不同拷貝數(shù)質(zhì)粒作為變量進行上下游模塊表達強度的適配，最終將紫杉二烯產(chǎn)量比文獻報道提高了6000倍，這個工作也成為模塊之間適配性研究的典范。

在模塊和底盤適配中，異源表達的模塊和底盤細胞內(nèi)環(huán)境之間的相互作用是研究適配性的理論基礎(chǔ)。通常采取底盤細胞和外源模塊同時改造，逐步適配的策略，最終使得目標路徑代謝實現(xiàn)最優(yōu)化和對底盤細胞的生長特性的影響最小化的終極目標。?ZAYDIN等[38]以β-胡蘿卜素為報告基因，篩選出釀酒酵母基因單敲庫中甲羥戊酸積累最高的底盤菌，再通過調(diào)整甲羥戊酸代謝途徑的表達與底盤菌適配，最終獲得了高產(chǎn)紅沒藥烯的生產(chǎn)菌。該研究通過對底盤細胞和代謝路徑的同時微調(diào)和適配，使得紅沒藥烯產(chǎn)量提高達20倍之多。YUAN課題組[39]在釀酒酵母體內(nèi)表達7-脫氫膽固醇時發(fā)現(xiàn)，單純的過表達前體乙酰輔酶A模塊和7-脫氫膽固醇合成模塊，在增加產(chǎn)物積累的同時會加劇細胞內(nèi)氧化還原的不平衡，這會反過來抑制產(chǎn)物的生成。通過輔因子再生策略對底盤細胞進行改造以緩解氧化還原不平衡狀態(tài)，最終使7-脫氫膽固醇的積累提高了75%。

除了上述的單菌（細胞）體系，人工混菌體系也是一類很好的底盤體系。人工混菌體系與單細胞體系相比，尤其是在構(gòu)建長的代謝通路或者完成更為復(fù)雜的功能方面有著單據(jù)體系無可比擬的優(yōu)勢[40]。在人工多細胞體系內(nèi)，除了單細胞體內(nèi)模塊和模塊之間以及模塊和底盤之間的適配之外，如何提高不同細胞（菌）之間在物質(zhì)代謝和能量代謝的適配性就顯得尤為重要。很多研究者在這方面做了大量的工作，如COLLINS等[41]通過來自于金黃葡萄球菌的基于多肽誘導(dǎo)的agr群體響應(yīng)體系在作為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌和作為革蘭氏陽性菌的巨大芽孢桿菌之間建立正交的混菌體系，大腸桿菌作為多肽的“供給者”，而巨大芽胞桿菌作為多肽的“接受者”。這個研究的成功為今后不同菌之間在基因表達、代謝路徑和生長等方面的協(xié)調(diào)和適配指出了重要的研究方向。2015年美國麻省理工學(xué)院的Gregory STEPHANOPOULOS教授課題組[42]將萜類代謝途徑構(gòu)建到大腸桿菌-釀酒酵母的人工混菌體系中，并且建立互利共生的菌群適配關(guān)系：改造釀酒酵母只利用來自于大腸桿菌的乙酸為單一碳源，這樣同時有利于緩解乙酸對大腸桿菌生長的抑制，成功實現(xiàn)了抗癌藥物紫杉醇重要前體Taxa-4(20)，11(12)-dien-5alpha-acetoxy-10beta-ol的大量積累，產(chǎn)量達到33mg/L，為最終實現(xiàn)紫杉醇的異源生物合成奠定了堅實的基礎(chǔ)。

圖5 人工合成體系適配性研究進展

2　如何進一步促進生物學(xué)的工程化

合成生物學(xué)作為工程化科學(xué)，遵循從設(shè)計到構(gòu)建到測試再到重設(shè)計的循環(huán)模式。合成生物學(xué)的工程化特性，推動整個產(chǎn)業(yè)鏈條從依賴于手工技藝發(fā)展為高通量、自動化的系統(tǒng)流水線制造模式（圖6），即由計算機輔助設(shè)計（computer aided design，CAD）人工合成系統(tǒng)，交由機器人平臺上進行組裝，最終由高通量分析儀器進行測試與評估。該鏈條的循環(huán)發(fā)展，將有效地解決拓寬微生物細胞生產(chǎn)化學(xué)品的品種以及提高人工合成體系的生產(chǎn)效率這兩個限制細胞工廠產(chǎn)業(yè)化的兩個關(guān)鍵技術(shù)問題，最終有利于細胞工廠產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)。

2.1 設(shè)計

設(shè)計這一環(huán)節(jié)是整個人工合成系統(tǒng)產(chǎn)業(yè)鏈條的基礎(chǔ)與核心。它包含對人工合成系統(tǒng)的設(shè)計以及DNA組裝系統(tǒng)的設(shè)計。對人工合成系統(tǒng)的設(shè)計包含系統(tǒng)的設(shè)計和元件的選擇兩個層次。在第一層次對系統(tǒng)的設(shè)計中，不僅涉及異源合成路徑的設(shè)計，還要包括對宿主底盤的改造。這需要根據(jù)特定需求，規(guī)劃目標產(chǎn)物的合成路徑，同時設(shè)計相關(guān)的基因電路和尋找適當?shù)膬?nèi)源靶標，來滿足異源路徑與宿主以及宿主與環(huán)境的試配。在第一層次設(shè)計的基礎(chǔ)上，針對設(shè)計的具體線路或宿主改造靶點，選擇適當?shù)暮诵幕?，以及與之表達相關(guān)的順式元件（啟動子核心區(qū)、增強子、核糖體結(jié)合位點、終止子等）。在設(shè)計的過程中，需要根據(jù)預(yù)期需求，有目的性地在龐大的代謝途徑、元件、基因線路等數(shù)據(jù)庫中進行搜索。傳統(tǒng)依賴于研究者知識與經(jīng)驗的手工設(shè)計，已經(jīng)不能滿足復(fù)雜的生物系統(tǒng)的設(shè)計工作，尤其在合成非天然分子或構(gòu)建非天然存在的代謝路徑上造成瓶頸。而CAD可大幅提升設(shè)計效率，甚至對設(shè)計結(jié)果進行模擬和優(yōu)化，是這一環(huán)節(jié)發(fā)展的必然趨勢。目前，現(xiàn)已開發(fā)的計算工具（例如BNICE、PPS）可根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫或以酶促反應(yīng)機理和熱力學(xué)參數(shù)，計算出理論上可實現(xiàn)預(yù)設(shè)的產(chǎn)物合成和生物降解途徑[43-46]。COBRA等工具可對現(xiàn)有設(shè)計進行建模預(yù)測，針對現(xiàn)有代謝網(wǎng)絡(luò)從能量供給、氧化還原平衡以及碳代謝流向等幾個方面，提供對宿主的改造方案，促進代謝流最大化地流向產(chǎn)物[47]。一些綜述總結(jié)了現(xiàn)有的關(guān)于元件及基因線路設(shè)計的工具[48-50]。此外通過計算機的模擬可以對現(xiàn)有的蛋白進行優(yōu)化甚至設(shè)計全新的蛋白質(zhì)，以加快反應(yīng)速率、提高底物特異性或催化非天然反應(yīng)。

圖6 合成生物學(xué)展望

合成生物學(xué)發(fā)展至今，已形成大量高效率、高保真的模塊化DNA組裝方法[51-52]，例如依賴于限制性內(nèi)切酶和連接酶的BioBricksTM[53]、BglBricks[54]和Golden Gate[55]；基于體外序列同源重組的Gibson組裝[56]；基于宿主體內(nèi)序列同源重組的DNA Assembler[57]；以及基于寡核苷酸連接的連接酶循環(huán)反應(yīng)（ligase cycling reaction，LCR）[58]。此外，還可通過CRISPR-Cas系統(tǒng)[59]、TALEN[60]、MAGE[61]等工具在基因組水平完成對染色體進行編輯或細胞的定向進化[62]。傳統(tǒng)序列分析和簡單克隆中的人工手段已不能勝任對整個構(gòu)建藍圖復(fù)雜繁瑣的設(shè)計工作。而零件的標準化、模塊化的特性，使得相關(guān)CAD工具應(yīng)運而生。例如，j5可實現(xiàn)元件的選擇和組裝過程的自動化設(shè)計[63]。而RAVEN在此基礎(chǔ)上，還可根據(jù)后續(xù)實驗進程和檢測結(jié)果的反饋，對設(shè)計方案進行優(yōu)化[64]。

2.2 構(gòu)建

構(gòu)建針對設(shè)計藍圖，對合成路徑的構(gòu)建與底盤細胞的改造。這一環(huán)節(jié)是整個鏈條中最為耗時耗力的一步。由于生物系統(tǒng)的復(fù)性和理性設(shè)計的低成功率，往往需要大量的元件與元件之間，靶點與靶點之間進行排列組合。元件的模塊化和組裝方法的標準化，高通量、可靠性不斷提高的DNA自動化組裝將科學(xué)工作者從機械化的重復(fù)勞動中解放出來，節(jié)約了大量的人力成本，避免人為實驗錯誤，符合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的要求。伊利諾伊大學(xué)趙惠民課題組創(chuàng)建的伊利諾伊iBioFAB自動化平臺，其構(gòu)建系統(tǒng)以在軌道上可控行使的機械手臂穿梭于不同儀器之間，在96孔板中自動完成DNA的合成與組裝（http：//chbe.illinois.edu/ research/ faculty/huimin-zhao-research）。將該平臺利用到染色體編輯工具TALEN的合成中，可使成本從>$1000降低到<$10[65]。預(yù)計未來大多數(shù)分子生物學(xué)實驗操作均可通過自動化實驗系統(tǒng)實現(xiàn)。研究者將有更多的時間和精力投入到創(chuàng)新性設(shè)計中。

2.3 檢測

檢測分為基因型檢測和表現(xiàn)型檢測。新一代測序技術(shù)[66]的迅猛發(fā)展，在提高測序速度的同時，降低單位測序成本，使DNA測序成為驗證構(gòu)建產(chǎn)物的首選手段。目前常規(guī)Illumina HiSeq2500微生物基因組重測序的國內(nèi)市場報價平均為￥2000/M基因組。而最新的Illumina HiSeqXTen每天可產(chǎn)生約6，000 Gbp數(shù)據(jù)，人類基因組的測序費用降至$1000以下（http：//www.illumina.com/systems/hiseq-x -sequencing-system.html）。在完成組裝驗證后，需通過檢測胞內(nèi)或胞外的代謝產(chǎn)物對所構(gòu)建的人工合成系統(tǒng)進行評估。NMR、GC-MS、LC-MS是分析代謝物的常用檢測手段。最新的分析系統(tǒng)配備了自動樣品制備（需要時包括自動衍生化）和自動進樣裝置，可實現(xiàn)培養(yǎng)后樣品自動化高通量檢測。最新的質(zhì)譜技術(shù)可實時檢測胞內(nèi)代謝物的變化[67]，甚至可對單細胞進行分析[68-69]。檢測所獲得的數(shù)據(jù)可反饋給最先的CAD系統(tǒng)，以優(yōu)化設(shè)計方案，或?qū)ΜF(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行補充。CAD工具設(shè)計、機器人構(gòu)建平臺，聯(lián)合高通量分析儀器測試，共同組成新一代合成生物學(xué)人工合成體系開發(fā)系統(tǒng)，自動展開設(shè)計-構(gòu)建-測試的自動化循環(huán)研究。在上文中提到的伊利諾伊大學(xué)iBioFAB系統(tǒng)正式基于這種理念所建設(shè)。趙惠民課題組[66]將該平臺利用到微生物基因組資源挖掘的工作中，已發(fā)現(xiàn)3種未知的具有生物活性的多環(huán)稠合大環(huán)內(nèi)酰胺類天然產(chǎn)物。

3　結(jié) 語

近年來，合成生物學(xué)的快速發(fā)展和關(guān)鍵科學(xué)問題不斷凝練，使人們對工程化生物學(xué)的特點有了較為廣泛和深入的認識，如標準化元件庫建立、正交基因線路、魯棒的人工多細胞體系等。但是距離實現(xiàn)最終完全按照人為目的設(shè)計和構(gòu)建生物體系的目標還有很長的路要走。遵循從設(shè)計到構(gòu)建到測試再到重設(shè)計的循環(huán)模式，進一步和其他工程科學(xué)如數(shù)學(xué)、物理學(xué)、計算機學(xué)等深入交叉融合，同時按照從原料多樣化、產(chǎn)品的合成與底盤細胞的選擇全鏈條布局，將對最終闡明人工生物體系設(shè)計構(gòu)建原則，也就是如何更好地工程化生物學(xué)奠定基礎(chǔ)。

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How to make biology more “engineering”

XIAO Wenhai1，2，ZHOU Sijie1，2，WANG Ying1，2，YUAN Yingjin1，2
（1Key Laboratory of Systems Bioengineering（Ministry of Education），Tianjin University，Tianjin 300072，China;
2SynBio Research Platform，Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering（Tianjin），Tianjin 300072，China）

Abstract：With the development and application of chemistry，chemical engineering arises at the historic moment. Similarly，with the development of biology and engineering requirement，synthetic biology，known as“the third revolutions of biology”，was born. Synthetic biology is the engineering of biology. From the point of view of engineering，it designs and creates parts，devices or modules，and employs them to modify and optimization of existing natural biological system，but how to engineer complex life system is the key scientific problem which synthetic biology researchers have long been exploring. In this paper，the main four characteristics of engineering biology are systematically illustrated：①modularization and standardization；②orthogonality；③robustness；④compatibility，as well as the corresponding research progress. Finally，from the point of view of“Design-Build -Test”cycle，proposals for how to further engineer biology in the future are addressed.

Key words：synthetic biology；modularization；orthogonality；robustness；compatibility；“design-bulid-test”cycle

中圖分類號：TQ 033

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）06–1827–10

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.06.024

收稿日期：2016-01-22；修改稿日期：2016-03-11。

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（國家863計劃）重大項目（2012AA02A701）。