公衍玲，王沙沙，劉　洋

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

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響應(yīng)面法優(yōu)化豬毛菜總黃酮提取工藝

公衍玲，王沙沙，劉洋

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

摘要：采用乙醇回流法提取豬毛菜總黃酮，通過單因素實(shí)驗(yàn)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化豬毛菜總黃酮提取工藝。以浸泡時(shí)間、液料比、乙醇濃度、回流溫度、回流時(shí)間為考察因素，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用分光光度法測(cè)定吸光度，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選乙醇回流法的主要影響因素；再通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明，乙醇回流法提取豬毛菜總黃酮的最優(yōu)條件為：浸泡時(shí)間30 min、液料比21∶1(mL∶g)、乙醇濃度62%、回流溫度100 ℃、回流時(shí)間109 min，該條件下豬毛菜總黃酮得率預(yù)測(cè)值為0.8405%，實(shí)測(cè)平均值為0.8387%，平均偏差為0.65%，RSD為0.47%。該方法模型預(yù)測(cè)性良好、偏差較小、提取條件穩(wěn)定、可靠性高。

關(guān)鍵詞：豬毛菜；總黃酮；響應(yīng)面法；提取

豬毛菜(Salsola collinaPall.)又名蓬蓬菜，是藜科豬毛菜屬植物，為一年生肉質(zhì)草本植物，廣泛分布于東北、華北、陜西、甘肅等地，生命力強(qiáng)，資源豐富[1]。研究發(fā)現(xiàn)，豬毛菜的主要成分包括黃酮、甾醇、生物堿、有機(jī)酸等[2-4]，藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)豬毛菜具有明確的降壓和抑制中樞等作用[5-7]，生物堿可能是其降壓的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[8-10]，豬毛菜硒含量高，有防癌、抗癌作用[11-13]，能增強(qiáng)人體免疫力，強(qiáng)身健體，減少疾病[14]。若能在其化學(xué)、藥理、制劑等方面進(jìn)行深入研究，將對(duì)充分開發(fā)和利用豬毛菜資源、提高經(jīng)濟(jì)效益具有重大意義。

作者采用傳統(tǒng)乙醇回流法提取豬毛菜中的總黃酮[15-19]，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選醇提工藝的主要影響因素，再通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化醇提工藝。綜合考慮總黃酮得率、提取成本、提取時(shí)間、操作復(fù)雜程度等因素，確定最佳提取工藝，擬為豬毛菜的綜合利用提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

豬毛菜，青島眾生大藥房。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼思特生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

UV-3000型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KDM型調(diào)溫加熱套，龍口電爐制造廠；高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；YP601N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取5 mg 120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶解，搖勻，定容，得濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL容量瓶中，精密加入1 mL 5%的NaNO2溶液，混勻，室溫放置6 min；然后精密加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，室溫放置6 min；再精密加入10% NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min；測(cè)定510 nm處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2豬毛菜總黃酮的提取

精確稱取10.0 g豬毛菜，切塊搗碎成粗漿，裝入蒸餾瓶中。加入乙醇溶液后，充分振蕩，再放入水浴鍋中充分冷凝回流提取，得粗提液。待粗提液冷卻后，利用真空抽濾機(jī)減壓抽濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇得濃縮液，稀釋后作為待測(cè)液。

1.2.3豬毛菜總黃酮得率的測(cè)定

精密量取豬毛菜總黃酮待測(cè)液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，室溫放置6 min，然后精密加入1 mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，室溫放置6 min，最后精密加入10% NaOH溶液10 mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min后，以50% 乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定510 nm處吸光度，按下式計(jì)算總黃酮得率：

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1浸泡時(shí)間的選擇

確定液料比10∶1(mL∶g，下同)、乙醇濃度50%、回流溫度60 ℃、回流時(shí)間60 min，分別浸泡30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4.2液料比的選擇

確定浸泡時(shí)間30 min、乙醇濃度50%、回流溫度60 ℃、回流時(shí)間60 min，在液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1時(shí)提取，考察液料比對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4.3乙醇濃度的選擇

確定液料比10∶1、浸泡時(shí)間30 min、回流溫度60 ℃、回流時(shí)間60 min，在乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)提取，考察乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4.4回流溫度的選擇

確定液料比10∶1、浸泡時(shí)間30 min、乙醇濃度50%、回流時(shí)間60 min，在回流溫度分別為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃時(shí)提取，考察回流溫度對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4.5回流時(shí)間的選擇

確定液料比10∶1、浸泡時(shí)間30 min、乙醇濃度50%、回流溫度60 ℃，分別回流30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.5星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為響應(yīng)值，固定浸泡時(shí)間與回流溫度，選擇液料比、乙醇濃度、回流時(shí)間為3因素，進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步優(yōu)化醇提工藝。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響(圖1)

由圖1可知，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率呈先降低后升高的趨勢(shì)。原因可能是，浸泡時(shí)間為30～90 min時(shí)，總黃酮提取不完全，但雜質(zhì)浸出量相對(duì)于總黃酮浸出量要多，整體表現(xiàn)為總黃酮得率降低；隨著浸泡時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，總黃酮的浸出增加量高于雜質(zhì)的浸出增加量，整體表現(xiàn)為總黃酮得率明顯升高。綜合考慮，選擇浸泡時(shí)間30 min作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.2液料比對(duì)總黃酮得率的影響(圖2)

由圖2可知，總黃酮得率隨液料比的增大先升高后降低，在液料比為20∶1時(shí)，總黃酮得率最高；繼續(xù)增大液料比，總黃酮得率反而下降?？赡苁且?yàn)?，液料比增大，系統(tǒng)稀釋度升高導(dǎo)致總黃酮溶出加快，隨著提取劑用量的增加，提取劑體系與物料體系間有效成分的濃度差隨之增大，物料內(nèi)部有效成分的殘余減少，從而提高了總黃酮得率；當(dāng)液料比超過20∶1時(shí)，總黃酮溶出不夠充分，且溶劑用量過多，成本增加。綜合考慮，選擇液料比20∶1作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.3乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響(圖3)

由圖3可知，總黃酮得率隨乙醇濃度的升高先升高后降低，在乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高。原因可能是，總黃酮在乙醇中的溶解度以及物料在乙醇中的滲透性都隨乙醇濃度的升高而提高，致使總黃酮得率升高；但隨著乙醇濃度的繼續(xù)升高，提取過程中所需的溶劑增多，成本增加。綜合考慮，選擇乙醇濃度60%作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.4回流溫度對(duì)總黃酮得率的影響(圖4)

由圖4可知，回流溫度越高，總黃酮得率越高。這可能是由于，回流溫度升高，總黃酮在乙醇中的溶解度增大，同時(shí)擴(kuò)散系數(shù)增大，浸提液黏度減小，提取速度也隨之加快；但回流溫度過高會(huì)破壞提取液中的活性成分，消耗大量熱能，且溶出的雜質(zhì)量增加，給后續(xù)操作帶來不便，增加成本。綜合考慮，選擇回流溫度100 ℃作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.1.5回流時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響(圖5)

由圖5可知，隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率先升高后降低，在回流時(shí)間為60 min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高；在回流時(shí)間超過90 min后，總黃酮得率趨于穩(wěn)定。原因可能是，回流60 min后，豬毛菜中總黃酮已基本溶出，所以總黃酮得率不再隨回流時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)升高；另外隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，將出現(xiàn)蛋白質(zhì)及雜質(zhì)沉淀，影響總黃酮的溶出，且回流液中的有效成分也被破壞，導(dǎo)致總黃酮分解，且回流時(shí)間過長(zhǎng)，將導(dǎo)致部分乙醇溶劑揮發(fā)，從而影響提取效果。綜合考慮，選擇回流時(shí)間90 min作為星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.2星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

使用Design-Expert軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得回歸方程為：總黃酮得率=-6.09452+0.068749A+0.20028B-4.58031×10-4C-2.33345×10-4AB+1.23744×10-4AC+5.06760×10-5BC-1.61307×10-3A2-1.61307×10-3B2-2.41131×10-5C2。方差分析結(jié)果見表3。

從表3可知，以總黃酮得率為響應(yīng)值時(shí)，模型P=0.0004<0.0500。一次項(xiàng)中的影響程度為乙醇濃度>回流時(shí)間>液料比。各因素中一次項(xiàng)、二次項(xiàng)影響較為顯著，再次說明各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，乙醇濃度和液料比、乙醇濃度和回流時(shí)間的相互作用不顯著。綜上可知，二次方程的R值與線性方程相比有了很大的提高，P<0.01，表明二次方程顯著性較高，刪除不顯著項(xiàng)可得簡(jiǎn)化方程：總黃酮得率=-6.09452+0.20028B-4.58031×10-4C+1.23744×10-4AC-1.61307×10-3A2-1.61307×10-3B2-2.41131×10-5C2。

2.2.2響應(yīng)面分析及工藝優(yōu)化

采用Design-Expert 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得2個(gè)自變量的三維響應(yīng)面圖，如圖6所示。

表2星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3方差分析結(jié)果

由圖6可知，液料比在(18～23)∶1范圍內(nèi)、乙醇濃度在55%～65%范圍內(nèi)、回流時(shí)間在80～115 min范圍內(nèi)有較高的總黃酮得率。經(jīng)分析得到回歸模型的最大值點(diǎn)，即液料比21.01∶1、乙醇濃度62.29%、回流時(shí)間109.87 min，在此條件下，總黃酮得率為0.8405%。因此，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定液料比21∶1、乙醇濃度62%、回流時(shí)間109 min、回流溫度100 ℃、浸泡時(shí)間30 min為乙醇回流法提取豬毛菜總黃酮的最優(yōu)工藝。

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在液料比為21∶1、乙醇濃度為62%、回流時(shí)間為109 min、回流溫度為100 ℃、浸泡時(shí)間為30 min的條件下，采用乙醇回流法提取豬毛菜中的總黃酮，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果如表4所示。

表4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果/%

由表4可知，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相比較，平均偏差率為0.65%、RSD為0.47%，偏差較小?？梢姡蓴?shù)學(xué)模型所得到的優(yōu)化條件符合設(shè)計(jì)目標(biāo)，數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有重現(xiàn)性和可靠性。

3結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了浸泡時(shí)間、液料比、乙醇濃度、回流溫度、回流時(shí)間等5個(gè)因素對(duì)豬毛菜總黃酮得率的影響，再選取其中3個(gè)對(duì)總黃酮得率影響較為顯著的因素，即液料比、乙醇濃度、回流時(shí)間，進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，確定豬毛菜總黃酮的最佳提取工藝條件為：浸泡時(shí)間30 min、液料比21∶1(mL∶g)、乙醇濃度62%、回流溫度100 ℃、回流時(shí)間109 min，在此條件下，總黃酮得率為0.8405%。在上述最佳條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近?？梢姡尚屈c(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)所得到的優(yōu)化條件與設(shè)計(jì)目標(biāo)相符，數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有重現(xiàn)性和可靠性。

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Optimization of Extraction Process for Total FlavonoidsfromSalsolaCollinaPall. by Response Surface Methodology

GONG Yan-ling,WANG Sha-sha,LIU Yang

(CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266042,China)

Keywords：Salsola collinaPall.;totalflavonoids;responsesurfacemethodology;extraction

Abstract：ThetotalflavonoidsfromSalsola collinaPall.wereextractedbyanethanolrefluxingmethod,andtheoptimumextractionconditionswereoptimizedbyasinglefactorexperimentandacentralcompositedesign-responsesurfacemethodology(CCD-RSM).Usingsoakingtime,liquid-solidratio,ethanolconcentration,refluxingtemperatureandrefluxingtimeasfactors,andtheyieldoftotalflavonoidsasanevaluationindex,throughdeterminingtheabsorbancebyspectrophotometry,themaininfluencingfactorsofethanolrefluxingmethodwerescreenedbyasinglefactorexperiment.ThentheoptimumextractionconditionswereobtainedbyCCD-RSMasfollows:soakingtimeof30min,liquid-solidratioof21∶1(mL∶g),ethanolconcentrationof62%,refluxingtemperatureof100 ℃,refluxingtimeof109min.Underaboveconditions,theyieldoftotalflavonoidswaspredictedtobe0.8405%,themeasuredaveragevaluewas0.8387%,theaveragedeviationwas0.65%andRSDwas0.47%.Thismethodhasgoodpredictiveabilitywithsmalldeviationandhighreliability,andtheoptimizedextractionconditionswerestable.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81300281)，山東省高?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J15LK12)

收稿日期：2016-01-28

作者簡(jiǎn)介：公衍玲(1975-)，女，山東臨沂人，博士，副教授，研究方向：藥物活性篩選與評(píng)價(jià)，E-mail：hanyu_ma@126.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.005

中圖分類號(hào)：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)06-0025-05